诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物、探针、试剂盒及方法，所述诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测试剂盒包括一步法扩增反应液、诺卡氏菌核酸检测液、阳性对照品和阴性对照品，所述诺卡氏菌核酸检测液包括诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物及探针、内参人血红蛋白β基因扩增引物及探针。本发明专利技术提供的诺卡氏菌实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及方法能够快速、准确且灵敏地检测出诺卡氏菌，包括：星形诺卡氏菌、鼻疽诺卡氏菌、豚鼠诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌，填补了目前临床对于诺卡氏菌导致的肺炎核酸检测这一空白领域。

【技术实现步骤摘要】
诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物、探针、试剂盒及方法
本专利技术涉及生物检测
，具体来说，涉及诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
诺卡氏菌(Nocardia,N.)是一种广泛存在于土壤、海水、淡水、尘埃中的细菌；革兰氏阳性，无芽孢和鞭毛；菌体呈多向的分枝丝状，直径0.5-1.2μm。它属于细菌界，放线菌门，放线菌纲，放线菌亚纲，放线菌目，棒状杆菌亚目，诺卡菌科，诺卡菌属。诺卡氏菌在自然界中广泛分布，诺卡氏菌不是人体正常菌群，不呈内源性感染，是一种机会致病菌，能够导致诺卡氏菌病(Nocardiosis)。诺卡氏菌病是由诺卡氏菌引起的一种急性或慢性化脓性或肉芽肿性病变，多由呼吸道吸入病原菌或经外伤感染引起，常见于免疫缺陷病人，如艾滋病病人、系统性红斑狼疮病人、糖尿病病人、酒精中毒病人、器官移植者等，部分病例常伴有长期的肺部疾患，如哮喘、支气管扩张等。在美国，每年大约有500-1000例诺卡氏菌病的新发病例，我国于1980年首次报道了诺卡氏菌病例。诺卡氏菌病是散发性疾病，在全世界散在分布。本病发生于任何人种、职业、年龄，成年人发病率较高，且多为男性，男性和女性的发病比为3:1。当机体免疫力低下，严重肺部疾患或手术外伤时可引起机会性感染。诺卡氏菌中最常见的致病菌为星形诺卡氏菌，70％以上的病例由其引起。诺卡氏菌是一种新发的人兽共患病病原，呈全球性分布，它能引起不同程度的人类疾病。近年来，病例报道明显增加，但大多数人对该菌不熟悉。建立早期、快速、准确的检测诺卡氏菌感染的方法具有重要意义。结合国内情况，在肺部感染的实验诊断中，经典的细胞培养方法虽然特异，但耗时长、费用大、技术设备要求高，不适合处理大量样本，且灵敏度低。实时荧光定量PCR方法可直接检测诺卡氏菌核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势。目前，还没有专门针对诺卡氏菌核酸检测的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物、探针、试剂盒及方法，能够克服现有技术的上述不足。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：根据本专利技术的第一方面，提供了一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物，其序列为：正向引物序列(Noc.F)：5’-cgcagatatcaggaggaacac-3’，如SEQIDNO.1所示；反向引物序列(Noc.R)：5’-ctaatcctgttcgctacccac-3’，如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术的第二方面，提供了一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测探针(Noc.P)，其序列为：5’-FAM-ctttcgcttctcagc-3’-MGB-NFQ，如SEQIDNO.3所示。根据本专利技术的第三方面，提供了一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)一步法扩增反应液(购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：Q113-02/03)，该反应体系包括taqDNA聚合酶、4种dNTP及各种PCR扩增反应液所需离子；(2)诺卡氏菌核酸检测液，包括诺卡氏菌(16SrRNA保守区域)核酸、内参基因人血红蛋白β基因(保守区域)特异性引物、探针：a)诺卡氏菌(16SrRNA保守区域)扩增引物、探针：Noc.F:5’-cgcagatatcaggaggaacac-3’，如SEQIDNO.1所示；Noc.R:5’-ctaatcctgttcgctacccac-3’，如SEQIDNO.2所示；Noc.P:5’-FAM-ctttcgcttctcagc-3’-MGB-NFQ，如SEQIDNO.3所示；b)内参人血红蛋白β基因(保守区域)扩增引物、探针：正向引物序列(HBBF):5’-ttggacccagaggttctttga-3’，如SEQIDNO.4所示；反向引物序列(HBBR):5’-gccatgagccttcaccttagg-3’，如SEQIDNO.5所示探针序列(HBBP):VIC-5’-tccactcctgatgctg-3’-MGB-NFQ，如SEQIDNO.6所示；作为优选的，引物浓度为200nM～800nM；探针浓度为50nM～200nM。(3)阳性对照品，所述阳性对照品为含有诺卡氏菌靶序列及人血红蛋白β基因靶序列的质粒。(4)阴性对照品，所述阴性对照品为RNaseFreeddH2O。根据本专利技术的第四方面，提供了一种采用所述试剂盒进行诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测的方法，包括以下步骤：(1)以诺卡氏菌RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；(2)对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、一步法扩增反应液、诺卡氏菌核酸检测液(包含诺卡氏菌和内参基因检测引物和探针)。进一步地，扩增程序为：50℃，2min，1个循环；95℃，5min，1个循环；95℃，10sec，60℃，35sec，40个循环，荧光定量PCR仪参数设定中，以ROX作为passivereference。进一步地，对扩增曲线进行分析判断的原则为：当FAM荧光通道中扩增曲线呈S型，且Ct≤35时，判断样品为诺卡氏菌阳性；当FAM荧光通道中Ct>35或无扩增，VIC荧光通道中扩增曲线呈S型，且Ct≤35时，判断样品为诺卡氏菌阴性；当FAM荧光通道中Ct>35或无扩增，且VIC荧光通道中Ct>35或无扩增，判定为实验异常，需要重新提取标本检测或重新取样检测。本专利技术的有益效果：(1)填补临床空白：本专利技术提供了诺卡氏菌实时荧光PCR检测的引物、探针、试剂盒，能够快速、准确且灵敏地检测出诺卡氏菌，包括：星形诺卡氏菌(N.asteroides)、鼻疽诺卡氏菌(N.farcinica)、豚鼠诺卡氏菌(N.otitidiscavarum)和巴西诺卡氏菌(N.transvalensis)，填补了目前临床对于诺卡氏菌导致的肺炎核酸检测这一空白领域；(2)加快临床诊断效率：本专利技术检测时间周期短，最快能在70分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率，实验结果重复性好，精密度高；(3)全程质量控制：本专利技术设计了内参基因，可对标本提取和扩增整个过程进行质量监控，能监控DNA是否成功提取和PCR过程是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误；(4)操作简单：本专利技术仅需操作者将诺卡氏菌核酸检测液、1-step反应液和模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于荧光定量PCR仪器，结果Ct值仪器可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床可推广性高。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物，其特征在于，其序列为：/n正向引物序列：5’-cgcagatatcaggaggaacac-3’，如SEQ ID NO.1所示；/n反向引物序列：5’-ctaatcctgttcgctacccac-3’，如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物，其特征在于，其序列为：
正向引物序列：5’-cgcagatatcaggaggaacac-3’，如SEQIDNO.1所示；
反向引物序列：5’-ctaatcctgttcgctacccac-3’，如SEQIDNO.2所示。


2.一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测探针，其特征在于，其序列为：5’-FAM-ctttcgcttctcagc-3’-MGB-NFQ，如SEQIDNO.3所示。


3.一种诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测试剂盒，其特征在于，包括一步法扩增反应液、诺卡氏菌核酸检测液、阳性对照品和阴性对照品，所述诺卡氏菌核酸检测液包括权利要求1所述的诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测引物、权利要求2所述的诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测探针、内参人血红蛋白β基因扩增引物及探针。


4.根据权利要求3所述的诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参人血红蛋白β基因扩增引物及探针的序列为：
正向引物序列：5’-ttggacccagaggttctttga-3’，如SEQIDNO.4所示；
反向引物序列：5’-gccatgagccttcaccttagg-3’，如SEQIDNO.5所示；
探针序列：VIC-5’-tccactcctgatgctg-3’-MGB-NFQ，如SEQIDNO.6所示。


5.根据权利要求3所述的诺卡氏菌核酸荧光实时PCR检测试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：于超计，赵立明，
申请(专利权)人：北京华瑞康源生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11