一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒制造技术

本申请属于肺炎支原体和肺炎衣原体的检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂包括MP和Cpn的引物和探针、M‑MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；所述标准阳性质粒为含有MP和Cpn扩增基因序列的重组质粒，用于MP和Cpn核酸检测的阳性对照。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒
本申请属于肺炎支原体和肺炎衣原体的检测
，具体为一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
肺炎支原体(MP)是儿童社区获得性肺炎(CAP)的重要病原之一。肺炎支原体是介乎细菌和病毒之间的一种微生物，主要经呼吸道传染，支原体可经血行播散至全身任何器官；另外，支原体感染后可产生自身抗体，导致多系统免疫损伤，引起多个系统的功能异常。肺炎支原体肺炎(MPP)占住院儿童CAP的10％-40％，是儿科医师广泛关注的问题。肺炎衣原体(Cpn)是专性细胞内细菌样寄生物，属于衣原体科，肺炎衣原体是导致衣原体肺炎的主要病原体。年老体弱、营养不良、COPD、免疫功能低下者易被感染。感染后免疫力很弱，易于反复。肺炎衣原体感染缺乏特异的临床表现，确诊主要依据有关病因的特殊实验室检查，应结合呼吸道和全身症状、X线检查、病原学和血清学检查作综合分析。目前肺炎支原体和肺炎衣原体常用的检测方法有如下几种：(1)病毒分离培养法：是诊断MP和Cpn感染的最可靠的方法，但到目前为止，这两种病原体很难通过培养获得，一方面是由于这些病人多为干性咳嗽，痰标本难以获得；另一方面是支原体和衣原体的培养要求很高，一般实验室难以开展。(2)血清学检测：最常用的血清学方法是补体结合反应(CFTs)，但此法存在许多缺点，如支原体CFTs的假阳性可以出现在炎症反应过程中，CFTs不能用于鉴别肺炎衣原体与鹦鹉热衣原体感染，因为两者有共同抗原；酶联免疫吸附试验(ELISA)由于可检测血清中IgM和IgG，故能区分急性感染和既往感染，适合于临床实验室作为MP和Cpn感染的常规检查，缺点为敏感性差，阳性预期值较低，不适合人群的筛查。(3)分子生物学检测：应用分子生物学技术对临床标本进行MP和Cpn核酸检测，其敏感性和特异性均很高，但须注意质量控制，否则可能出现较多的假阳性结果，且需要特殊的PCR扩增条件、专门的实验室和PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。重组酶介导扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA反应最适温度在37～42℃，整个过程在10-30min内即可完成，30min内就可以将靶序列扩增到10～12数量级，可实现核酸的快速检测。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组，所述引物探针组为根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列设计的引物和探针，其中，(1)MP引物和探针序列为：MP-F：5’-TACATCTACCCTTACCGTTACAGTGGCATGTGAGC-3’；MP-R：5’-TACCGTTAACTTCTGGTTAAAGCGCTCGTACTCGT-3’；MP-P：5’-TCCGGAATTGTTAGCAGCTCTTCCCGACAAGG(FAM-dT)(THF)AAA(BHQ-dT)ACGGTAAGGAAAAC(C3-spacer)-3’。(2)Cpn引物和探针序列为：Cpn-F：5’-ATTGATGGTACAATATGGGAAGGTGCTGCAGGAGA-3’；Cpn-R：5’-GCCTGCATTAGTGAACCACTCTGCATCGTGTAAAT-3’；Cpn-P：5’-CCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGC(HEX-dT)A(THF)(BHQ-dT)AGCTTACGTGCTGGA(C3-spacer)-3’。优选的，所述核酸引物长度为30-35bp，GC含量占40-60％，5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G，3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同。优选的，所述核酸探针长度为46-52bp，包括携带有荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸(T)和携带有猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(T)，中间由一个四氢呋喃碱基(THF)隔开，荧光基团与猝灭基团间隔2-5个碱基。优选的，所述荧光基团用FAM、HEX修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰；所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(dSpacer)。一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，所述试剂盒中包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。优选的，所述扩增反应试剂包括MP和Cpn的引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。优选的，所述扩增反应试剂为干粉且单管分装。优选的，所述标准阳性质粒为含有MP和Cpn扩增基因序列的重组质粒，用于MP和Cpn核酸检测的阳性对照。优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。优选的，所述引物和探针在扩增体系中的终浓度为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样本的总RNA，待测样本选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种；(2)根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列分别设计用于MP和Cpn检测的引物和探针；(3)配制荧光RMA反应体系，向反应体系中加入提取的总RNA，进行反转录和RMA扩增反应；扩增反应在温度设定为42℃的荧光检测器中进行，反应时间为20min；(4)结果分析：因为恒温扩增反应管中包含了两对特异性的正、反向引物和两条特异性探针；其中，两条特异性探针分别标记了不同的荧光基团(如FAM、HEX等)和淬灭基团(如BHQ)，在荧光RMA反应过程中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组为根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列设计的引物和探针，引物和探针序列为：/n(1)MP引物和探针序列为：/nMP-F：/n5’-TACATCTACCCTTACCGTTACAGTGGCATGTGAGC-3’；/nMP-R：/n5’-TACCGTTAACTTCTGGTTAAAGCGCTCGTACTCGT-3’；/nMP-P：/n5’-TCCGGAATTGTTAGCAGCTCTTCCCGACAAGG(FAM-dT)(THF)AAA(BHQ-dT)ACGGTAAGGAAAAC(C3-spacer)-3’。/n(2)Cpn引物和探针序列为：/nCpn-F：/n5’-ATTGATGGTACAATATGGGAAGGTGCTGCAGGAGA-3’；/nCpn-R：/n5’-GCCTGCATTAGTGAACCACTCTGCATCGTGTAAAT-3’；/nCpn-P：/n5’-CCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGC(HEX-dT)A(THF)(BHQ-dT)AGCTTACGTGCTGGA(C3-spacer)-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组为根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列设计的引物和探针，引物和探针序列为：
(1)MP引物和探针序列为：
MP-F：
5’-TACATCTACCCTTACCGTTACAGTGGCATGTGAGC-3’；
MP-R：
5’-TACCGTTAACTTCTGGTTAAAGCGCTCGTACTCGT-3’；
MP-P：
5’-TCCGGAATTGTTAGCAGCTCTTCCCGACAAGG(FAM-dT)(THF)AAA(BHQ-dT)ACGGTAAGGAAAAC(C3-spacer)-3’。
(2)Cpn引物和探针序列为：
Cpn-F：
5’-ATTGATGGTACAATATGGGAAGGTGCTGCAGGAGA-3’；
Cpn-R：
5’-GCCTGCATTAGTGAACCACTCTGCATCGTGTAAAT-3’；
Cpn-P：
5’-CCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGC(H...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建生，包建民，陈大为，陈龙，张瑶，
申请(专利权)人：济南国益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37