适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法技术

本发明专利技术提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法，设计针对15种植物检疫病毒的特异引物池，并将特异性多重反转录技术与纳米孔技术相结合，建立针对15种植物检疫病毒的靶向捕获测序方法，具备高灵敏度、高通量、低成本的优点，可实现单次建库测序检测15种植物检疫病毒的目标，可解决目前植物病毒检疫存在的检测通量低、检测目标单一的问题。检测目标单一的问题。检测目标单一的问题。

【技术实现步骤摘要】
适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法


[0001]本专利技术涉及植物病毒检疫领域，特别涉及一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法。

技术介绍

[0002]植物病毒被视为“植物癌症”，其会导致农作物的低产并威胁人类食品安全，进而引发一系列社会问题。随着我国国际农产品贸易的不断发展，检疫性植物病毒入侵风险逐年加大，严重威胁我国农业生产安全，因此建立快速检疫性植物病毒检测技术和监测体系是保障农业安全生产的重要前提。目前，植物病毒的检疫工作已在各港口所,各省市大专院校，农科院等单位普遍开展起来。
[0003]目前检测植物病毒的传统方法包括血清学检测、电子显微镜观察、PCR或RT
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PCR、 芯片杂交等，但此类检测植物病毒的方法存在许多的弊端，例如电镜观察容易出现判断不准确的情况，核酸扩增技术受限于多重扩增引物的设计，血清学技术的效率有限，因此极大地限制了各类检测方法在实际工作中的推广和应用。
[0004]在过去的十几年中，测序技术的发展迅猛，测序技术已经从第一代Sanger法测序到第二代测序技术(Next
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generation sequencing,NGS) 为分子生物学领域带来了革命性的变化。测序技术也适用于植物病毒的快速检测，目前主流的基于深度测序的植物病毒检测主要以NGS技术为主。
[0005]但是基于NGS测序技术的病毒检测依然面临很多问题，存在的问题主要体现在以下几个方案：1.在设备上NGS测序仪属于大型仪器，价格昂贵。需要在专业的实验室或公司平台；2.在实验操作上，测序文库准备复杂且步骤繁琐，需要专业的实验操作人员。3.在测序流程和检测周期上，NGS实验操作和测序周期为2
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3天。4.在测序数据质控和数据分析上，由于NGS依赖于PCR扩增，因此具有一定的测序偏好性，导致基因组覆盖不全而且由于NGS测序长不1Kb，因此病毒基因组需要组装，在一定程度上结果极度依赖软件和算法的优化和提高。
[0006]纳米孔测序技术是基于核酸分子通过纳米孔时电势差变化而进行碱基检测的单分子测序技术。与已有测序技术不同的是，纳米孔测序技术没有DNA合成这一步骤，是目前唯一可以对核酸分子直接进行测序的技术。同时纳米孔测序还兼具超长读长、便携且可实时测序、高通量多平台等其他测序平台不具有的优势。但是其试剂成本相比较于二代测序高于5～10倍，同时由于缺少针对植物检疫病毒生物信息分析流程导致该技术在实际中很难普及，需要进一步改进。此外，我国植物检疫病毒基因组类型多样，有的为RNA病毒、有的为DNA病毒，而RNA病毒又包括含有PolyA尾巴和不含PolyA尾巴的RNA病毒。目前针对上述不同类型的植物病毒，通常需要采用不同的建库方案，增加了单次同时检测不同类型植物病毒的成本和难度。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法，利用所有植物病毒均能产生RNA的特点，构建植物检疫病毒特异性反转录引物池，并将特异性多重反转录技术与纳米孔技术相结合，建立针对15种植物检疫病毒的靶向捕获测序方法，具备高灵敏度、高通量、低成本的优点，可实现单次建库测序检测15种植物检疫病毒的目标，可解决目前植物病毒检疫存在的检测通量低、检测目标单一的问题。
[0008]为了实现以上目的，本技术方案提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，包括以下步骤：
[0009]提取植物样品RNA，利用特异性引物池对植物样品RNA进行反转录合成病毒cDNA，其中特异性引物池包括SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.30所示的引物序列；
[0010]根据病毒cDNA两端保守序列对不同病毒进行PCR扩增，得到富集双链DNA；
[0011]对富集双链DNA进行定量和稀释，进行接头连接。
[0012]本方案可针对以下15种植物检疫病毒进行测序建库，15种植物检疫病毒包括：南芥菜花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、可可肿枝病毒、香石竹环斑病毒、玉米褪绿矮缩病毒、玉米褪绿斑驳病毒、燕麦花叶病毒、马铃薯帚顶病毒、马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯黄矮病毒、南方菜豆花叶病毒、甘蔗线条病毒、烟草环斑病毒以及小麦线条花叶病毒。
[0013]南芥菜花叶病毒(ArMV)、菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、可可肿枝病毒(CSSV)、香石竹环斑病毒(CRSV)、玉米褪绿矮缩病毒(MCDV)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)、燕麦花叶病毒(OMV)、马铃薯帚顶病毒(PMTV)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯V病毒(PVV)、马铃薯黄矮病毒(PYDV)、南方菜豆花叶病毒(SBMV)、甘蔗线条病毒(SSV)、烟草环斑病毒(TRSV)以及小麦线条花叶病毒(WSMV)。
[0014]15种植物检疫病毒名录及分类见下表一
[0015]表一 检疫病毒名录及分类
[0016][0017][0018][0019][0020]本方案的特异性引物池针对15种病毒序列，特异池引物池内的特异性引物序列如下表二所示：
[0021]表二：特异性引物池内引物序列
[0022][0023][0024][0025]本方案的重点在于提取并富集病毒核酸，并利用相应的试剂对这些病毒核酸建立测序文库，建立程序化的生物信息学分析程序，达到实时检测和分析植物样品中是否含有
植物检疫病毒的目的。
[0026]在“提取植物样品RNA”步骤中，利用植物RNA提取试剂盒提取植物样品RNA。植物RNA提取试剂盒的类型可选用RNA Mini Kit，也可选用其他的植物RNA提取试剂盒。
[0027]在本方案的一实施例中，取待测植物样品加入液氮并研磨成粉末，使用植物RNA提取试剂盒RNA Mini Kit抽提植物样本总RNA，电泳及nanodrop检测，将植物样品RNA最终浓度调整到250ng/ul。
[0028]在“利用特异性引物池对植物样品RNA进行反转录合成病毒cDNA”步骤中，联用纳米孔测序试剂盒的SSP引物，使得每一病毒cDNA的5
’
端加接头。在一些实施例中，可联用纳米孔测序试剂盒PCR
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cDNA Barcoding Kit(SQK
‑
PCB109)中的SSP引物给cDNA的5
’
端加接头。
[0029]本方案的反转录体系可采用Therom Maxima H Minus Reverse Transcriptase反转录体系，第一反转录体系如下表三所示：
[0030]表三 第一反转录体系
[0031][0032][0033]在65℃保温5分钟后置于冰上放置，并将第二反转录体系加到冰上放置的解旋RNA中，42℃保温2分钟，再在体系中加入Maxima H Minus Reverse Transcriptase 1ul；62℃保温90分钟；85℃保温5分钟；冰上放置。至此cDNA合成完毕，第二反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：提取植物样品RNA，利用特异性引物池对植物样品RNA进行反转录合成病毒cDNA，其中特异性引物池包括SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.30所示的引物序列；根据病毒cDNA两端保守序列对不同病毒进行PCR扩增，得到富集双链DNA；对富集双链DNA进行定量和稀释，进行接头连接。2.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，其特征在于，在“利用特异性引物池对植物样品RNA进行反转录合成病毒cDNA”步骤中，联用纳米孔测序试剂盒的SSP引物，使得每一病毒cDNA的5
’
端加接头。3.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，其特征在于，根据cDNA两端保守序列，联barcode引物对不同cDNA进行PCR扩增。4.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，其特征在于，PCR循环条件为：95℃，30sec；95℃，30sec执行11
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18个循环；62℃，15sec执行11
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18个循环；65℃，1min执行11
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18个循环；65℃，6min执行2个循环；并保持在4℃。5.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法，其特征在于，15种植物检疫病毒包括：南芥菜花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、可可肿枝病毒、香石竹环斑病毒、玉米褪绿矮缩病毒、玉米褪绿斑驳病毒、燕麦花叶病毒、马铃薯帚顶病毒、马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯黄矮病毒、南方菜豆花叶病毒、甘蔗线条病毒、烟草环斑病毒以及小麦线条花叶病毒。6.一种适用于15种植物检疫病毒的...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛凌峰，孙凯，尹传林，俞晓平，
申请(专利权)人：杭州柏熠科技有限公司，
类型：发明
国别省市：