一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法技术

本发明专利技术公开了一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法，该方法针对呼吸合胞病毒A型进行设计覆盖基因全长的引物，引物共有25对，其中在第1对引物中添加了一条正向引物序列，引物选自于由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.51表示的寡核苷酸序列。上述引物组合对呼吸道合胞病毒A型具有特异性，且对于呼吸合胞病毒A型的亚型具有通用性，上述引物组合可实现在一个PCR反应体系中进行多重PCR一步扩增呼吸道合胞病毒A型的全基因组，灵敏度高，可快速构建呼吸道合胞病毒基因组文库，并适用于二代测序和三代测序。序。序。

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种呼吸道合胞病毒A型全基因组测序方法。

技术介绍

[0002]呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原体，引起的疫情通常爆发于冬季和春季。呼吸道合胞病毒属于副粘病毒科，是一种单链负义RNA病毒，基因组由10个基因组成，从3＇端到5＇端基因组序列依次为NS1
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NS2
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N
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P
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M
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SH
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G
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F
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M2
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L。基于G蛋白基因序列，将呼吸道合胞病毒分为A和B两种分型，其中A型被细分为14个亚型。在特定地区特定流行病期间，RSVA和RSV B交替流行。有研究表明RSV A型中的GA2亚型为优势亚型，RSV A型似乎在世界各地均比RSV B型占优势。呼吸道合胞病毒最显著的特征之一是其再感染率高，在同一流行期间，或连续或非连续流行中，可发生同一型或同一亚型病毒二次感染(同源再感染)和不同型或不同亚型病毒(异源再感染)，异源再感染比同源再感染更容易发生。根据有关文献报道，估计2019年全球有3300万RSV相关急性下呼吸道感染事件发生，360万RSV相关急性下呼吸道感染住院病例，26300RSV相关急性下呼吸道感染住院死亡病例，其中在0
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5岁婴幼儿中，有660万RSV相关急性下呼吸道感染事件发生，140万RSV相关急性下呼吸道感染住院病例，13300RSV相关急性下呼吸道感染住院死亡病例。2％的0
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5岁和3.6％的28天
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5岁的婴幼儿的死亡可归因于RSV。截至目前，尚无安全有效的RSV感染治疗药物上市，但有4种抗RSV药物正在临床开发阶段。同样尚无安全有效RSV疫苗上市，但已有疫苗进入后期临床开发阶段，包括单克隆抗体nirsevimab、两种母体疫苗(RSV MAT和RSVpreF)和另一种单克隆抗体MK
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1654。
[0003]目前对呼吸道合胞病毒的检测方法包括病毒分离、抗原检测、抗体检测、核酸检测以及基因测序。其中病毒分离相较困难，且敏感性低。目前主要针对病毒G、F基因片段进行测序分型，全基因组测序相较其他检测方式来说能够获得病毒的全基因组序列，从而起到分型鉴定、溯源以及变异分析等作用，能更全面地了解RSV的进化过程和病理生物学，并识别基因组可变区和保守区，认识其遗传多样性，以指导诊断工具和疫苗的开发。目前市面上一些RSVA型的引物的扩增效率差、多重PCR扩增时引物之间影响大影响了对RSV A基因组的检测，因此开发一种全基因组测序的方法具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测呼吸道合胞病毒A型全基因组的测序方法，通过对NCBI数据库获取的RSV A型全基因组进行比对，找取其中具有特异性且保守性较高的区域，设计并优化筛选能够覆盖RSV A型全基因组的通用引物并将引物按照二代测序或三代测序的建库方案进行建库。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0005]本专利技术的第一方面提供了一种呼吸道合胞病毒A型全基因组扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括长度为20
‑
30bp的用于扩增不同基因的寡核苷酸片段。
[0006]进一步，所述引物组包括25对引物。
[0007]进一步，所述25对引物的序列如SEQ ID NO.2
‑
51所示。
[0008]进一步，所述引物组还包括1条正向引物。
[0009]进一步，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]本专利技术的第二方面提供了一种用于呼吸道合胞病毒A型全基因组检测的引物组，所述引物组在本专利技术第一方面所述的引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。
[0011]本专利技术的第三方面提供了一种检测呼吸道合胞病毒A型全基因组的多重PCR检测产品，所述产品包括本专利技术第一方面或本专利技术第二方面所述的引物组。
[0012]进一步，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒。
[0013]进一步，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、cDNA/DNA模板。
[0014]进一步，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
[0015]进一步，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶。
[0016]进一步，所述扩增酶包括Q5高保真DNA聚合酶和/或Q5热启动超保真DNA聚合酶。
[0017]进一步，所述试剂盒包括Q5热启动超保真DNA聚合酶及相适配的扩增缓冲液、cDNA/DNA模板。
[0018]进一步，所述试剂盒还包括反转录的反应体系。
[0019]进一步，所述反转录的反应体系包括引物。
[0020]进一步，所述引物为随机引物。
[0021]进一步，所述反转录的反应体系还包括反转录缓冲液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂。
[0022]进一步，所述反转录缓冲液包括M
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MLV反转录缓冲液、ⅢReverse Transcriptase Buffer、V Buffer、SSIV RT Buffer。
[0023]进一步，所述反转录缓冲液选自SSIV RT Buffer。
[0024]进一步，所述反转录酶包括M
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MLV RT酶、HIV RT酶、ASLV RT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAV RT酶、REV
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A RT酶、UR2AV RT酶、YAV RT酶、RAV RT酶、MAV RT酶、SSIV RT酶。
[0025]进一步，所述反转录酶包括SSIV RT酶。
[0026]进一步，所述反转录的反应体系还包括DTT。
[0027]进一步，所述反转录的反应体系包括随机引物、SSIV RT Buffer、SSIV RT酶、核糖核酸酶抑制剂、DTT。
[0028]本专利技术的第四方面提供了一种针对呼吸道合胞病毒A型全基因组的扩增方法，所述方法包括使用本专利技术第一方面或第二方面所述的引物组进行扩增。
[0029]进一步，所述引物分成Pool
‑
1和Pool
‑
2两组。
[0030]进一步，所述Pool
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1引物包括SEQ ID NO.1
‑
3、6
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7、10
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11、14
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15、20
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21、24
‑
25、28...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道合胞病毒A型全基因组扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括长度为20
‑
30bp的用于扩增不同基因的寡核苷酸片段；优选地，所述引物组包括25对引物；优选地，所述25对引物的序列如SEQ ID NO.2
‑
51所示；优选地，所述引物组还包括1条正向引物；优选地，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种用于呼吸道合胞病毒A型全基因组检测的引物组，其特征在于，所述引物组在权利要求1所述的引物组的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。3.一种检测呼吸道合胞病毒A型全基因组的多重PCR检测产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的引物组。4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、核酸膜条、试剂盒；优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、cDNA/DNA模板；优选地，所述扩增酶包括DNA聚合酶和/或RNA聚合酶；优选地，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Q5高保真DNA聚合酶、Q5热启动超保真DNA聚合酶、Phanta高保真DNA聚合酶、VAHTS HiFi DNA聚合酶；优选地，所述扩增酶包括Q5高保真DNA聚合酶和/或Q5热启动超保真DNA聚合酶；优选地，所述试剂盒包括Q5热启动超保真DNA聚合酶及相适配的扩增缓冲液、cDNA/DNA模板；优选地，所述试剂盒还包括反转录的反应体系；优选地，所述反转录的反应体系包括引物；优选地，所述引物为随机引物；优选地，所述反转录的反应体系还包括反转录缓冲液、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂；优选地，所述反转录缓冲液包括M
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MLV反转录缓冲液、ⅢReverse Transcriptase Buffer、V Buffer、SSIV RT Buffer；优选地，所述反转录缓冲液选自SSIV RT Buffer；优选地，所述反转录酶包括M
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MLVRT酶、HIV RT酶、ASLVRT酶、RSV RT酶、AMV RT酶、MCAVRT酶、REV
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ART酶、UR2AVRT酶、YAVRT酶、RAVRT酶、MAVRT酶、SSIV RT酶；优选地，所述反转录酶包括SSIV RT酶；优选地，所述反转录的反应体系还包括DTT；优选地，所述反转录的反应体系包括随机引物、SSIV RT Buffer、SSIV RT酶、核糖核酸酶抑制剂、DTT。5.一种针对呼吸道合胞病毒A型全基因组的扩增方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的引物组进行扩增；优选地，所述引物分成Pool
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1和Pool
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2两组；优选地，所述Pool
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1引物包括SEQ ID NO.1
‑
3、6
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7、10
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11、14
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15、20
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21、24
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25、28
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29、32
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33、38
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39、42
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43、46
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47、50
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51所示的引物，Pool
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2引物包括SEQ ID NO.4
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5、8
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9、12
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13、16
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔仑标，罗君红，赵康辰，吴涛，朱小娟，葛以跃，乔乔，吴斌，朱凤才，毛凌峰，唐旖，
申请(专利权)人：杭州柏熠科技有限公司，
类型：发明
国别省市：