检测白对虾病原物的试剂、试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种检测白对虾病原物的试剂、试剂盒与方法，属于微生物检测领域，本发明专利技术提供一种试剂及包含该试剂的试剂盒，其中试剂包括以下组分：含有80mM硫酸镁的10

【技术实现步骤摘要】
检测白对虾病原物的试剂、试剂盒与方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测领域，具体而言，涉及一种检测白对虾病原物的试剂、试剂盒与方法。

技术介绍

[0002]传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectioushypodermal and haematopo ietic necrosis virus，IHHNV)，也称细角滨对虾浓核病毒、十足类浓核病毒，是已知对虾病毒中最小的病毒，病毒粒子大小为22nm，是无囊膜二十面体，线性单链DNA，长度约为3.9kb，包含3个开放阅读框。IHHNV基因型分为感染型和非感染型两种，其中感染型包括1型和2型；非感染型包括3A和3B型。IHHNV在世界范围内广泛流行，引起的疾病为传染性皮下及造血组织坏死病，给对虾养殖业造成巨大损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为须向其申报的甲壳类重要疾病。
[0003]桃拉病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)是一种可引起凡纳滨对虾等多种虾类严重死亡的RNA病毒。该病毒首次发现于瓜亚基尔湾托拉河口附近的对虾养殖场，造成池塘养殖的南美白对虾幼虾60％～90％死亡的灾难性损失。桃拉综合症病毒是对虾危害最大、造成死亡率最高的病毒之一。2000年在广东首次发现TSV，随后在福建、广东、海南等地都有大规模发病死亡的情况发生，造成了巨大经济损失。对虾桃拉综合症病毒被世界动物卫生组织OIE列为必须申报的疾病。
[0004]偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus，CMNV)，属于野田村病毒科α野田村病毒属，是一种单链RNA病毒，病毒粒子为球形(二十面体)，无囊膜，蔗糖密度梯度离心纯化的病毒粒子直径约为32nm。CMNV主要感染养殖虾类。偷死野田村病毒是导致养殖对虾发生偷死病的病毒性病原，发病对虾主要在池底深水区陆续死亡，不容易被观察到，因此，被称为“偷死病”或“死底症”。患病个体表现出肝胰腺颜色变浅、萎缩，空肠空胃，生长缓慢等症状，很多时候还可见病虾腹节肌肉不透明或局部发白。患病对虾在水温较高(28℃以上)时，死亡率升高，累计死亡率可达80％。
[0005]对虾传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus，IMNV)是一种无囊膜双链RNA病毒，直径40nm，基因长度为7560bp，包括2个开放阅读框。该病毒能造成全身肌肉组织坏死，一般情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率达到70％。该病发病温度通常在30℃左右，目前，该病的传播途径不清，有报道称健康虾在残食发病虾时能被感染。
[0006]专利号为CN201710030873.0的中国专利技术专利公开了一种同时检测对虾WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的多重PCR检测方法和试剂盒，该方法和试剂盒采用多重PCR的检测方法，够一次性同时利用WSSV、AHPND、EHP、IHHNV的专用检测引物WSSV
‑
F和WSSV
‑
R、AHPND
‑
F和AHPND
‑
R、EHP
‑
F和EHP
‑
R、IHHNV
‑
F和IHHNV
‑
R进行四种病原DNA的扩增。但该技术属于多重PCR，其结果需要进一步进行琼脂糖凝胶电泳方可显现，总体技术操作复杂，且耗时久，不利于现场快速检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的问题是如何提高白对虾多种病原物检测的检测速度以有利于现场快速检测。
[0008]为解决上述问题，本专利技术第一方面提供一种检测白对虾病原物的试剂，所述试剂包括引物混合液，所述引物混合液包括以下引物组：
[0009]检测传染性皮下及造血组织坏死病毒引物组：
[0010]SEQ ID No.1为上游外部引物：CAATATAAAGACAAACTCAGAGGA A；
[0011]SEQ ID No.2为下游外部引物：TGCTTTAAGGTTTACAGTGTT；
[0012]SEQ ID No.3为上游内部引物：CGCATTTTTCTGTACCTGTTTTGTT GAATACATTCATACAAAGTTACCAG；
[0013]SEQ ID No.4为下游内部引物：GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAG TTGAAATTGTATTTGACCAATGGT；
[0014]检测桃粒病毒引物组：
[0015]SEQ ID No.5为上游外部引物：TGCATTGAATCGAAGCAC；
[0016]SEQ ID No.6为下游外部引物：AGCCGCAAAAATACCCAA；
[0017]SEQ ID No.7为上游内部引物：CCACGTCTGTTTTCCGCTCTT
‑
GTC AGCAGGTTTTCCCTA；
[0018]SEQ ID No.8为下游内部引物：GCTCTGAGGAATTCATTGTTGACA A
‑
TCCACTATGCCATCTTTGG；
[0019]检测偷死野田村病毒引物组：
[0020]SEQ ID No.9为上游外部引物：GCCAAAGATGGCATAGTGG；
[0021]SEQ ID No.10为下游外部引物：TCCTGTTCGTCATCACTTG；
[0022]SEQ ID No.11为上游内部引物：TACTTTCTCCAATGGGCGCC
‑
TGTT AGTTTGGGTATTTTTGCG；
[0023]SEQ ID No.12为下游内部引物：CAGGCCAATAAGACACGTGTGT
‑
CCAAGAAACTTAGGTAATATCTTCT；
[0024]检测对虾传染性肌肉坏死病毒引物组：
[0025]SEQ ID No.13为上游外部引物：CCTGGACCTATCATACATAGC；
[0026]SEQ ID No.14为下游外部引物：CCAATGTTGTGAAAAATAAGCT；
[0027]SEQ ID No.15为上游内部引物：CCGGGGATGATGTAGTATTGAAAG T
‑
GTTGCATTTGCAAGAACTGG；
[0028]SEQ ID No.16为下游内部引物：TAGACTGCAAGTACAAATGTCATC C
‑
CATGTTGTACCACCTGCTG。
[0029]本专利技术提供引物混合液可同时检测传染性皮下及造血组织坏死病毒、桃粒病毒、偷死野田村病毒、对虾传染性肌肉坏死病毒四种白对虾病原物，其中，检测传染性皮下及造血组织坏死病毒引物组的参考基因的NCBI分类号为KU215794.1，检测桃粒病毒引物组的参考基因的NCBI分类号为NC_003005.1，检测偷死野田村病毒引物组的参考基因的NCBI分类号为ON732860.1，检测对虾传染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测白对虾病原物的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物混合液，所述引物混合液包括以下引物组：检测传染性皮下及造血组织坏死病毒引物组：SEQ ID No.1为上游外部引物：CAATATAAAGACAAACTCAGAGGAA；SEQ ID No.2为下游外部引物：TGCTTTAAGGTTTACAGTGTT；SEQ ID No.3为上游内部引物：CGCATTTTTCTGTACCTGTTTTGTTGAATACATTCATACAAAGTTACCAG；SEQ ID No.4为下游内部引物：GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTTGAAATTGTATTTGACCAATGGT；检测桃粒病毒引物组：SEQ ID No.5为上游外部引物：TGCATTGAATCGAAGCAC；SEQ ID No.6为下游外部引物：AGCCGCAAAAATACCCAA；SEQ ID No.7为上游内部引物：CCACGTCTGTTTTCCGCTCTT
‑
GTCAGCAGGTTTTCCCTA；SEQ ID No.8为下游内部引物：GCTCTGAGGAATTCATTGTTGACAA
‑
TCCACTATGCCATCTTTGG；检测偷死野田村病毒引物组：SEQ ID No.9为上游外部引物：GCCAAAGATGGCATAGTGG；SEQ ID No.10为下游外部引物：TCCTGTTCGTCATCACTTG；SEQ ID No.11为上游内部引物：TACTTTCTCCAATGGGCGCC
‑
TGTTAGTTTGGGTATTTTTGCG；SEQ ID No.12为下游内部引物：CAGGCCAATAAGACACGTGTGT
‑
CCAAGAAACTTAGGTAATATCTTCT；检测对虾传染性肌肉坏死病毒引物组：SEQ ID No.13为上游外部引物：CCTGGACCTATCATACATAGC；SEQ ID No.14为下游外部引物：CCAATGTTGTGAAAAATAAGCT；SEQ ID No.15为上游内部引物：CCGGGGATGATGTAGTATTGAAAGT
‑
GTTGCATTTGCAAGAACTGG；SEQ ID No.16为下游内部引...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳红，徐胜威，葛明峰，斯烈钢，
申请(专利权)人：宁波市海洋与渔业研究院，
类型：发明
国别省市：