基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒、使用方法及应用技术方案

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
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Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒、使用方法及应用


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，尤其涉及一种基于cRISPR
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Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法。

技术介绍

[0002]快速和准确地在早期筛查和诊断COYID
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19是防止其在人群蔓延和治疗感染关键的步骤，常规诊断手段有分子测试、血清学测试和计算机断层扫描 (CT)，其中定量反转录聚合酶链反应(RT
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PCR)检测被认为是确诊COVID
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19 的金标准，但该技术假阴性率高(41％)，需要专业的技术人员和昂贵的实验设备可能会导致确诊延迟，增加疑似患者的焦虑。为了改善这一情况，目前急需要开发一款灵敏度高、高效便捷、不需要昂贵的设备的诊断工具用于COVID
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19的检测。
[0003]近年来，恒温扩增技术与CRISPR基因编辑技术结合为核酸恒温扩增检测技术的发展创建了一个新的平台。目前等温扩增和基因编辑检测病原体的步骤包括核酸提取、恒温扩增、Cas蛋白编辑以及产物检测。
[0004]核酸提取是核酸扩增技术中的关键步骤，但因实验室提取核酸的方法通常比较繁琐，需要一种简便、快速、高效、低耗能的核酸提取方法。常用的快速提取核酸的方法有固相提取试剂盒快速提取法，磁珠法，氧化铝膜法和裂解液处理法等。但固相提取法需要依靠仪器操作如离心机，磁珠法处理成本高，氧化铝膜法制造工艺复杂，限制了其在核酸快速检测中得到更实际有效的应用。裂解液恒温快速提取法操作简单、价格便宜、获取方便，是十分理想的核酸提取方法。
[0005]核酸扩增是关系到检测准确性的一个必要步骤，能够避免由于样品浓度过低或受到背景值影响较大而被判断为假阴性的情况。近几年，一些等温扩增技术已有商业化的产品，如环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、链置换扩增(SDA)、依赖核酸序列型扩增(NASBA)等。其中RPA反应时间只需 20min且在恒温下即能进行实验，特异性强、灵敏度高，相比之下，RPA非常适用于疾病诊断和现场检测。
[0006]中国专利ZL202011179251.2公开了抗新型冠状病毒的抗体和检测新型冠状病毒的试剂盒，该抗体可以特异性结合新型冠状病毒的N蛋白，对其具有较高的亲和力，用该抗体检测新型冠状病毒具有较好的灵敏度和特异性。本专利技术为新型冠状病毒的检测提供了更为丰富的抗体选择，但该技术方案检测时间过长，效率过低，且准确性无法把握。

技术实现思路

[0007]为此，本专利技术提供一种基于CRISPR
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Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，可以解决无法根据实时荧光强度判定待检测目标产物浓度，进而提高检测效率的技术问题。
[0008]为实现上述目的，一方面，本专利技术提供一种基于CRISPR
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Cas系统的新冠病毒恒温
检测试剂盒使用方法，包括：
[0009]步骤S1，将待检测样本在恒温环境中裂解；
[0010]步骤S2，对裂解后的样本进行RT
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RPA扩增；
[0011]步骤S3，扩增后的样本加入装有CRISPR混合液的试管中进行荧光反应，经过预设时间，中控单元读取荧光强度；
[0012]步骤S4，将荧光反应后的样本注入试纸条，根据纸条条带判定检测结果；
[0013]在所述步骤S3中，所述中控单元根据荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前目标产物浓度进行判定，其中，中控单元获取的荧光强度小于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度不符合预设标准，中控单元获取的荧光强度大于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度符合预设标准，中控单元启动步骤S4，对荧光反应后的样本进行试纸条检测。
[0014]进一步地，步骤S5，校验，所述步骤S3中，将扩增后的样本分为两份，分别注入第一反应管和第二反应管内，其中，第一反应管用于预设时间荧光反应后参与试纸条检测，第二反应管用于参与全程荧光反应检测，中控单元根据所述第二反应管内样本的循环阈值判定当前样本阴性或阳性，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果一致，中控单元判定校验成功，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果不一致，中控单元判定校验失败。
[0015]进一步地，在所述步骤S3中，所述中控单元预设荧光强度D，所述中控单元根据反应液的荧光强度d与预设荧光强度相比较，判定当前目标产物浓度是否符合预设标准，其中，
[0016]当d≤D1，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间以及所述步骤S3的荧光反应时间；
[0017]当D1＜d＜D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准；
[0018]当d≥D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度符合标准，中控单元启动步骤S4；
[0019]其中，所述中控单元预设荧光强度D，设定第一预设荧光强度D1，第二预设荧光强度D2。
[0020]进一步地，当所述中控单元获取当前荧光强度小于等于第一预设荧光强度，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤 S2的扩增时间TZ至TZ1，设定TZ1＝TZ
×
(1+(D1
‑
d)/D1)，延长所述步骤S3的荧光反应时间TY至TY1，设定TY1＝TY
×
(1+(D1
‑
d)/D1)。
[0021]进一步地，所述中控单元获取荧光强度变化率s，设定s＝Δd/t0，，Δd为预设间隔时间t0荧光强度变化值，当所述中控单元获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率s与预设荧光强度变化率 S相比较，判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准，其中，
[0022]当s≤S1，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间符合标准，中控单元延长步骤S2的扩增时间至TZ2，设定TZ2＝TZ
×
(1+(S1
‑
s)/S1)；
[0023]当S1＜s＜S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY2，设定TY2＝TY
×
(1+(S2
‑
s)
×
(s
‑
S2)/ (S1
×
S2))；
[0024]当s≥S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY3，设定TY3＝TZ
×
(1+1.5
×
(s
‑
S2)/S2)；
[0025]其中，所述中控单元预设荧光强度变化率S，设定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
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Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，其特征在于，包括：步骤S1，将待检测样本在恒温环境中裂解；步骤S2，对裂解后的样本进行RT
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RPA扩增；步骤S3，扩增后的样本加入装有CRISPR混合液的试管中进行荧光反应，经过预设时间，中控单元读取荧光强度；步骤S4，将荧光反应后的样本注入试纸条，根据纸条条带判定检测结果；在所述步骤S3中，所述中控单元根据荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前目标产物浓度进行判定，其中，中控单元获取的荧光强度小于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度不符合预设标准，中控单元获取的荧光强度大于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度符合预设标准，中控单元启动步骤S4，对荧光反应后的样本进行试纸条检测。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR
‑
Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，其特征在于，包括，步骤S5，校验，所述步骤S3中，将扩增后的样本分为两份，分别注入第一反应管和第二反应管内，其中，第一反应管用于预设时间荧光反应后参与试纸条检测，第二反应管用于参与全程荧光反应检测，中控单元根据所述第二反应管内样本的循环阈值判定当前样本阴性或阳性，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果一致，中控单元判定校验成功，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果不一致，中控单元判定校验失败。3.根据权利要求2所述的基于CRISPR
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Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述中控单元预设荧光强度D，所述中控单元根据反应液的荧光强度d与预设荧光强度相比较，判定当前目标产物浓度是否符合预设标准，其中，当d≤D1，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间以及所述步骤S3的荧光反应时间；当D1＜d＜D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准；当d≥D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度符合标准，中控单元启动步骤S4；其中，所述中控单元预设荧光强度D，设定第一预设荧光强度D1，第二预设荧光强度D2。4.根据权利要求3所述的基于CRISPR
‑
Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，其特征在于，当所述中控单元获取当前荧光强度小于等于第一预设荧光强度，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间TZ至TZ1，设定TZ1＝TZ
×
(1+(D1
‑
d)/D1)，延长所述步骤S3的荧光反应时间TY至TY1，设定TY1＝TY
×
(1+(D1
‑
d)/D1)。5.根据权利要求4所述的基于CRISPR
‑
Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，其特征在于，所述中控单元获取荧光强度变化率s，设定s＝Δd/t0，，Δd为预设间隔时间t0荧光强度变化值，当所述中控单元获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率s与预设荧光强度变化率S相比较，判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准，其中，当s≤S1，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间符合标准，中控单元延长步骤S2的扩增时间至TZ2，设定TZ2＝TZ
×
(1+(S1
‑
s)/S1)；
当S1＜s＜S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY2，设定TY2＝TY
×
(1+(S2
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s)
×
(s
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S2)/(S1
×
S2))；当s≥S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚正华，向天新，卢甜，夏震遥，周佳伟，
申请(专利权)人：深圳市研元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：