检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术公开了一种检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物、探针和用途，其专用引物和探针是基于肺炎链球菌特异性保守序列设计的，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术RPA应用于肺炎链球菌的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸试检测纸条实现可视化判别。本发明专利技术建立的检测方法灵敏度可达10拷贝数/μL，特异性高，对硬件设备的要求很低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。推广应用。推广应用。

【技术实现步骤摘要】
检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途


[0001]本专利技术属于生物
，涉及肺炎链球菌的分子生物学，涉及一种检测肺炎链球菌的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA技术)快速检测肺炎链球菌的方法、其专用引物和探针及其用途。

技术介绍

[0002]苛养菌是社区感染最常见的病原菌，可引发菌血症、脑膜炎、肺炎等严重侵袭性疾病，在儿童等免疫力低下的人群中尤为严重。感染初期及早合理的使用抗菌药物对其治疗和预后都非常重要。然而，由于苛养菌的分离鉴定耗时长，对培养环境要求严苛且极易受到实验室、人员及技术差异限制，因而严重影响了苛养菌感染者的诊断，延迟了临床患者的治疗时机。而肺炎链球菌是其中占比最大的一类。本专利提出了一种基于RPA技术的肺炎链球菌检验方法，对肺炎链球菌进行快速、高效且准确的检出；有助于对肺炎链球菌感染病情的判断，抗菌药物用药指导；并能有效缩短诊断及检出时间，节约检出成本，具有重大的临床意义和社会经济价值。
[0003]苛养菌是对营养要求严苛，在普通培养基中难以生长或不生长，在体外培养过程中需加入特殊因子或其他营养成分方可缓慢生长的一类细菌，主要包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、军团菌及鲍特菌等。临床常见的苛养菌多数是人类呼吸道的正常菌群或寄居菌，在人体免疫力正常时不致病，但在机体免疫力不足的情况下，如儿童患者或免疫抑制时，苛养菌可能导致严重的呼吸系统炎症，或进入循环系统引起其他部位的感染。研究显示，在儿童的感染性疾病中，苛养菌是一类重要的致病菌，它不仅能引起呼吸道的感染，还可引起中耳炎、败血症、脑膜炎等。在儿童患者中，苛养菌检出率及耐药率均显著高于成年人。且在苛养菌检出阳性标本中，呼吸道感染标本占90％。因此，在对患者的临床检验中，更应注重儿童患者呼吸道苛养菌的检出情况。
[0004]呼吸道感染主要可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染两种类型，病毒与细菌为上呼吸道感染主要病原体，而真菌、支原体、病毒及细菌为导致下呼吸道感染主要因素。针对该类病症诊治，首要条件即为临床检验中对病原菌的精确判定，提高用药合理性并对耐药发展产生一定延缓作用。在当前的临床检验中，呼吸道病原菌的分离与鉴定仍是感染患者诊断的金标准。然而，苛养菌在培养中对营养和环境等因素要求极高，且由于各实验室在环境、人员配置及技术上存在差异，采用常规细菌培养方法时很容易漏诊，导致苛养菌整体检出率仅有20％
‑
60％。在临床上，由苛养菌引起的感染很难精确的诊断和治疗，造成了抗菌药物不合理使用，并贻误了患者最佳治疗时机。如以重度肺部感染为例，先明确病原菌方可选取适宜抗菌药品，将耐药产生风险降低。在现阶段临床中，针对病原学诊断的重要价值并未予以足够重视，多以经验性诊治为主，病因模糊诊断如不明原因肺炎及慢性肺炎等较为常见，微生物检测能力与临床需求脱节现象较为普遍。以肺炎链球菌为例，典型形态为隆起，湿润，脐窝状，草绿色溶血，与链球菌属其它细菌难以区分；流感嗜血杆菌形态为露滴状小菌落，不溶血且无色透明，与奈瑟菌相近。然而据报道，在苛养菌的分离鉴定中使用来源
不同的琼脂平皿，因其所含营养成分存在细微差异，可能导致细菌形态呈现不同，增加鉴定难度。此外，相关学者指出，伴随着送样时间的延长，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌检出率显著降低，且苛养菌送检样品同样不适用于冷藏，因冷藏样品容易导致苛养菌死亡，故而样品送检的时效性要求极高。因而，临床上如何快速、有效且准确地检出苛养菌感染，是当下检验科面临的重大挑战。
[0005]近几年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行扩增，可在25
‑
43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析检测试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途，利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA技术)能快速、简便、特异的检测肺炎链球菌。
[0007]所采用的技术方案为：
[0008]本专利技术的一种基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，包括如下步骤：
[0009]S1.以待测样品基因组DNA为模板，在引物组和探针的标记下进行RPA反应；所述引物组和探针均是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述引物组中的正向引物具有SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5
’
端标记生物素；所述探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5
’
端标记荧光素，3
’
端添加延伸阻断基团，在第34
‑
35位碱基之间增加一个四氢呋喃；
[0010]S2.用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
[0011]进一步地，所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团。
[0012]进一步地，所述的探针长度为49bp，其中5
’
端34bp，3
’
端15bp。
[0013]进一步地，S1中，将引物组和探针用于50μL的RPA反应体系进行RPA反应，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为5μmol/L，所述的探针的浓度为10μmol/L、镁离子浓度280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase和RNase水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增；S2中，检测时加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3
‑
5min。
[0014]本专利技术的一种用于检测检测肺炎链球菌的试剂盒，包括引物组和探针；所述引物
组和探针均是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以待测样品基因组DNA为模板，在引物组和探针的标记下进行RPA反应；所述引物组和探针均是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述引物组中的正向引物具有SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5
’
端标记生物素；所述探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5
’
端标记荧光素，3
’
端添加延伸阻断基团，在第34
‑
35位碱基之间增加一个四氢呋喃；S2.用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。2.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团。3.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，所述的探针长度为49bp，其中5
’
端34bp，3
’
端15bp。4.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，S1中，将引物组和探针用于50μL的RPA反应体系进行RPA反应，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为5μmol/L，所述的探针的浓度为10μmol/L、镁离子浓度280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase和RNase水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚正华，唐敏，夏震遥，卢甜，
申请(专利权)人：深圳市研元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：