检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术公开了一种检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物、探针和用途，其专用引物和探针是基于肺炎链球菌特异性保守序列设计的，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术RPA应用于肺炎链球菌的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸试检测纸条实现可视化判别。本发明专利技术建立的检测方法灵敏度可达10拷贝数/μL，特异性高，对硬件设备的要求很低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。推广应用。推广应用。

【技术实现步骤摘要】
检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途


[0001]本专利技术属于生物
，涉及肺炎链球菌的分子生物学，涉及一种检测肺炎链球菌的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA技术)快速检测肺炎链球菌的方法、其专用引物和探针及其用途。

技术介绍

[0002]苛养菌是社区感染最常见的病原菌，可引发菌血症、脑膜炎、肺炎等严重侵袭性疾病，在儿童等免疫力低下的人群中尤为严重。感染初期及早合理的使用抗菌药物对其治疗和预后都非常重要。然而，由于苛养菌的分离鉴定耗时长，对培养环境要求严苛且极易受到实验室、人员及技术差异限制，因而严重影响了苛养菌感染者的诊断，延迟了临床患者的治疗时机。而肺炎链球菌是其中占比最大的一类。本专利提出了一种基于RPA技术的肺炎链球菌检验方法，对肺炎链球菌进行快速、高效且准确的检出；有助于对肺炎链球菌感染病情的判断，抗菌药物用药指导；并能有效缩短诊断及检出时间，节约检出成本，具有重大的临床意义和社会经济价值。
[0003]苛养菌是对营养要求严苛，在普通培养基中难以生长或不生长，在体外培养过程中需加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以待测样品基因组DNA为模板，在引物组和探针的标记下进行RPA反应；所述引物组和探针均是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述引物组中的正向引物具有SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5
’
端标记生物素；所述探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5
’
端标记荧光素，3
’
端添加延伸阻断基团，在第34
‑
35位碱基之间增加一个四氢呋喃；S2.用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。2.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团。3.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，所述的探针长度为49bp，其中5
’
端34bp，3
’
端15bp。4.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法，其特征在于，S1中，将引物组和探针用于50μL的RPA反应体系进行RPA反应，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为5μmol/L，所述的探针的浓度为10μmol/L、镁离子浓度280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase和RNase水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚正华，唐敏，夏震遥，卢甜，
申请(专利权)人：深圳市研元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：