基于微流控芯片-PCR技术检测布鲁氏菌的方法及系统技术方案

本发明专利技术提供了一种基于微流控芯片

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片
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PCR技术检测布鲁氏菌的方法及系统


[0001]本专利技术是关于一种检测布鲁氏菌的方法及系统，具体而言，是关于一种基于微流控芯片
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PCR技术检测布鲁氏菌的方法及系统。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌(Brucella，亦称布鲁氏杆菌)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，其侵入机体会引起传染
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变态反应性的人兽共患的传染病——布鲁氏菌病。布鲁氏菌病临床上以长期发热、多汗、乏力、关节疼痛、肝脾及淋巴结肿大为特点，人群易感。对病原及早、快速、准确地检测并确诊至关重要。检测出布鲁氏菌是诊断布鲁氏菌病的金标准，然而，由于布鲁氏菌培养营养要求高，生长缓慢，采用传统培养检测方法往往会延误诊断及早期治疗，故不能成为诊断布鲁氏菌病的主要方法。目前布鲁氏菌病的诊断以实验室检查为主，结合流行病史、临床表现、影像学手段等综合判断。
[0003]现有检测布鲁氏菌的常用技术均存在一定局限性，如血液培养技术耗时长、检出率低；虎红平板凝集、试管凝集特异性不高；补体结合试验敏感性低；传统聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测技术，血液中布鲁氏菌核酸提取过程繁琐，提取效率不高，稳定性不好；此外，封闭检测不能得到扩增片段的大小，提高灵敏性的同时污染风险也自然提高。虽然布鲁氏菌的检测技术已经有了很大的发展，但是，仍然没有一种单一的方法能在任何情况下进行快速、准确地诊断。
[0004]微流控芯片
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PCR(Microfluidic Chip PCR，MC
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PCR)技术可将样品制备、反应、分离、检测、扩增、分析等集成到一块几平方厘米的芯片上并自动完成，具有快速、高通量、低消耗，灵敏、特异等特点。微流控芯片
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PCR技术已经成功应用于HPV、结核、肿瘤、呼吸道病毒、乙肝等疾病的检测。
[0005]然而，目前并没有基于MC
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PCR技术的布鲁氏菌检测方法的应用报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的在于提供一种基于微流控芯片
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PCR技术检测布鲁氏菌的方法。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种基于微流控芯片
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PCR技术检测布鲁氏菌的系统。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供一种实现所述检测方法的引物及探针组合物。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种检测布鲁氏菌的方法，该方法包括对待测样本进行目的DNA的提取、PCR扩增以及反向斑点杂交，其中：
[0010]目的DNA的提取：采用NaI磁珠法对待测样本进行目的DNA的提取；
[0011]PCR扩增：以提取获得的DNA为模板，采用针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的引物，进行PCR扩增；
[0012]反向斑点杂交：PCR扩增产物在杂交膜上进行反向斑点杂交；其中，杂交膜上固定有针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的检测探针。
[0013]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法中，所述待测样本可
以为来自个体的离体样本，也可以是环境样本。所述来自个体的离体样本可以为血液样本(例如血清样本)。根据本专利技术的一些具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，是非诊断目的的。
[0014]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，NaI磁珠法中，针对每50μl待测样本，采用的提取试剂包括1.5
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6mol/L的NaI裂解液，蛋白酶K，磁珠，以及异丙醇。在本专利技术的一些具体实施方案中，NaI磁珠法提取目的DNA时，优选控制裂解时间为2min。
[0015]在本专利技术的一些具体实施方案中，优选地，针对每50μl待测样本，采用的提取试剂包括50μl ddH2O、100μl NaI裂解液、5μl PK、5
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20μl磁珠以及20
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100μl异丙醇。
[0016]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法中，所述目的DNA的提取利用微流控芯片技术全自动进行，或是手工提取。在一些具体实施方案中，手工提取过程优选包括：
[0017]在离心管中加入待测样本，并加入裂解液NaI，混匀，并加入蛋白酶K，进行孵育；
[0018]在上述离心管中加入磁珠和异丙醇，混匀；
[0019]将离心管放于磁力架上静置，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，并根据需要进行漂洗；
[0020]离心管开盖室温晾干，加入洗脱液，孵育；
[0021]将离心管放于磁力架上静置，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中
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20℃保存备用。
[0022]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，PCR扩增过程中，针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的引物具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列。
[0023]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，PCR扩增过程中，采用15μPCR反应体系，包括：DNA聚合酶(2
×
Taq Master Mix)7.5ul，正、反向引物各1.5μl(0.5μmol/μl)，ddH2O 1.5μl，核酸模板3μl；反应循环参数：95℃预变性3min，95℃10s、50℃30s、72℃30s，45个热循环，72℃终延伸1min。
[0024]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法中，所述PCR扩增过程利用微流控芯片技术全自动进行。
[0025]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，反向斑点杂交过程中，针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的检测探针具有如SEQ ID No.3所示序列。
[0026]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法中，所述反向斑点杂交过程利用微流控芯片技术全自动进行。
[0027]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，反向斑点杂交过程中，杂交膜上还固定有质控探针。
[0028]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法中，杂交膜优选划分为多个点位，优选至少12个点位，在本专利技术的一些具体实施方案中，杂交膜划分为32个点位。各探针采用微量点样技术被固定在杂交膜的不同点位上，其中检测探针至少1个点，空白对照探针、内参质控探针GB各至少1个点，显色质控探针重复至少3个点。
[0029]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的检测布鲁氏菌的方法，是利用微流控核酸芯片与全自动核酸芯片检测仪配套完成。可采用现有技术中任何可行的微流控核酸芯片与
全自动核酸芯片检测仪。在本专利技术的一些具体实施方案中，采用北京博晖创新提供的微流控核酸芯片与全自动核酸芯片检测仪。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，该方法包括对待测样本进行目的DNA的提取、PCR扩增以及反向斑点杂交，其中：目的DNA的提取：采用NaI磁珠法对待测样本进行目的DNA的提取；PCR扩增：以提取获得的DNA为模板，采用针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的引物，进行PCR扩增；反向斑点杂交：PCR扩增产物在杂交膜上进行反向斑点杂交；其中，杂交膜上固定有针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的检测探针。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为来自个体的离体样本或环境样本；所述来自个体的离体样本为血液样本。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，NaI磁珠法中，采用的提取试剂包括1.5
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6mol/L的NaI裂解液，蛋白酶K，磁珠，以及异丙醇；优选地，针对每50μl待测样本，采用的提取试剂包括50μl ddH2O、100μl NaI裂解液、5μl PK、5
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20μl磁珠以及20
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100μl异丙醇。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的DNA的提取利用微流控芯片技术全自动进行，或是手工提取；其中，手工提取过程优选包括：在离心管中加入待测样本，并加入裂解液NaI，混匀，并加入蛋白酶K，进行孵育；在上述离心管中加入磁珠和异丙醇，混匀；将离心管放于磁力架上静置，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，并根据需要进行漂洗；离心管开盖室温晾干，加入洗脱液，孵育；将离心管放于磁力架上静置，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中
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20℃保存备用。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增过程中，针对布鲁氏菌BCSP
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31基因设计的引物具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列。6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，PCR扩增过程中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜彦丹，赵志军，李翔，董占柱，孙欣，陈昊，包春喜，郝明媛，李英智，牛艺卿，
申请(专利权)人：陈昊，
类型：发明
国别省市：