一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用，涉及分子生物学技术领域。其包括第一引物对和第二引物对，第一引物对具有如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis，HPS)又称为多发性浆膜炎、关节炎，致病原为副猪嗜血杆菌，主要危害断奶仔猪和保育猪，是造成养猪场保育猪、仔猪发病率、死亡率增加的主要细菌性疾病，每年所造成的经济损失不可估量。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道定殖的一种菌群，通常情况下猪群抵抗力较强时副猪嗜血杆菌不会产生致病性，一旦受到多种应激因素影响，猪群抵抗力下降或免疫器功能下降时，该菌就会趁机大量繁殖并产生毒素，使猪出现严重的临床症状。
[0003]临床上结合患猪胸膜肺炎、腹膜炎、心包炎、心脏表面有大量的绒毛，可作出初步的诊断。而要确诊还需要借助实验室检测方法。目前主要的检测方法是将病料充分粉碎后，进行涂片染色镜检；或者将采集到的病料进行分离培养，将分离得到的病菌转移到血液琼脂平板上，然后再挑取金黄色葡萄球菌进行垂直划线接种，培养36h后出现典型的卫星现象，即判断病料感染副猪嗜血杆菌。
[0004]然而，上述镜检和接种培养方法都存在方法上的繁琐问题，而且容易误诊，所以目前很多对副猪嗜血杆菌的诊断选用分子生物学方法。主要有普通PCR和荧光PCR，而普通PCR由于灵敏度有限因而在临床样本的检测应用中的价值也有限，荧光定量PCR由于易污染、实验成本和对实验场所要求较高等原因不易在基层推广。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用以解决上述技术问题。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合，其包括第一引物对和第二引物对，第一引物对具有如SEQ ID NO.1
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2所示的序列，第二引物对具有如SEQ ID NO.3
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4所示的序列。
[0009]巢式PCR是使用两对PCR引物进行扩增的方法，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似；而第二对引物即为巢式引物，其结合在第一次PCR产物的内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增片段，该扩增方法可提高普通PCR检测的灵敏度和准确性。
[0010]专利技术人利用NCBI网站下载HPS的16S rRNA基因序列(登录号：FJ667982)，利用Primer 5.0引物设计软件设计出了针对HPS的引物对，经过筛选获得了可以用于巢式PCR扩增的引物组合。其中，第一引物对用于第一次PCR扩增，第二引物对用于巢式PCR扩增。
[0011]经验证，本专利技术提供的扩增引物组合具有较高的扩增灵敏度，比普通PCR扩增的灵
敏度高100倍，且该扩增引物的特异性强，重复性好，可以应用于猪场日常检测监测工作，为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供技术支持。本专利技术提供的扩增引物组合具有实验成本低、实验场所要求低的优势。开发巢式PCR扩增引物组合具有良好的检测应用价值。
[0012]SEQ ID NO.1：AATTCCACG TGTAGCGGTGA，扩增位置48；
[0013]SEQ ID NO.2：GTGGTAAACGCCCCCTTTCA，扩增位置501，第一引物对的扩增片段长度为454bp。
[0014]SEQ ID NO.3：AGTGGGATTAGGTAGTTGGT，扩增位置184；
[0015]SEQ ID NO.4：CTTCCTCATCACCGAAAGAA，扩增位置400，第二引物对的扩增片段长度为217bp。
[0016]上述引物组合物的形态包括不限于冻干粉剂、溶液、悬浮液或乳浊液。
[0017]本专利技术还提供了一种试剂盒，其包括上述副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合。
[0018]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括PCR反应预混液。
[0019]PCR反应预混液含PCR扩增的DNA Taq酶、dNTPs、Mg离子、缓冲液，在一种可选的实施方式中，上述PCR反应预混液选自市售的PCR Mix。
[0020]在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括水，用于溶解和/或稀释引物组合或待测样本。
[0021]本专利技术还提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备试剂盒中的应用。上述试剂盒为针对猪细菌性传染病的检测试剂盒。
[0022]本专利技术还提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备检测测试样品中副猪嗜血杆菌的试剂盒中的应用。
[0023]在一种可选的实施方式中，上述应用针对的对象是死亡的猪或环境样本。
[0024]检测对象包括不限于取自死猪的血清、血浆、血液样本、猪舍环境样本。
[0025]上述的试剂盒用于：将副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合与待测对象的基因组DNA混合；
[0026]通过PCR扩增反应实现副猪嗜血杆菌的检测。
[0027]上述PCR扩增反应包括：先以第一引物对对检测对象的基因组DNA进行普通PCR扩增获得扩增产物，然后以扩增产物为模板，用第二引物对进行巢式PCR扩增。
[0028]在本专利技术应用较佳的实施方式中，普通PCR扩增的反应程序为95℃1
‑
5min；95℃30
‑
45s，54.5
‑
57.5℃，35s，70
‑
72℃30s，共30
‑
40个循环；70
‑
72℃1
‑
10min。
[0029]在上述PCR扩增反应条件下，可以较好地实现待测样本中DNA的扩增，扩增产物进行电泳条带较为明亮。
[0030]在本专利技术应用较佳的实施方式中，普通PCR扩增的反应程序为95℃1
‑
5min；95℃30
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45s，56.5℃，35s，70
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72℃30s，共30
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40个循环；70
‑
72℃1
‑
10min。
[0031]经过筛选，专利技术人发现，当退火温度为56.5℃时，获得的扩增产物进行电泳条带最为明亮。
[0032]在本专利技术应用较佳的实施方式中，巢式PCR扩增的反应程序为95℃1
‑
5min；95℃30
‑
45s，55.5
‑
58.5℃，35s，70
‑
72℃30s，共30
‑
40个循环；70
‑
72℃1
‑
10min。
[0033]在上述退火温度条件下，巢式PCR产物进行电泳后条带较为明亮，便于检测人员直观的获得检测结果。
[0034]在本专利技术应用较佳的实施方式中，巢式PCR扩增的反应程序为95℃1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合，其特征在于，其包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1
‑
2所示的序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.3
‑
4所示的序列。2.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应预混液。4.一种如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备试剂盒中的应用。5.一种如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备检测测试样品中副猪嗜血杆菌的试剂盒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于：将权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合与待测对象的基因组DNA混合；通过PCR扩增反应实现副猪嗜血杆菌的检测。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应包括：先以第一引物对对检测对象的基因组DNA进行普通PCR扩增获得扩增产物，然后以所述扩增产物为模板，用第二引物对进行巢式PCR扩增。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述普通PCR扩增的反应程序为95℃1
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5min；95℃30
‑
45s，54.5
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57.5℃，35s，70
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72℃30s，共30
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40个循环；...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓红玉，陈秀萍，刘娴，凌勇，龙小敏，张正林，李亮，吴有林，
申请(专利权)人：漳浦县赵木兰养殖有限公司南宁傲农育种技术有限公司福建傲农生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：