一种猪肺炎支原体nfo-RPA检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开的是一种猪肺炎支原体nfo

【技术实现步骤摘要】
一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种检测试剂盒及其制备方法，更具体一点说，涉及一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒及其制备方法，属于生物基因工程领域。

技术介绍

[0002]猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumonia, Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine, MPS)又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcine enzootic pneumonia, PEP)”的主要病原体。该病具有高发病率和低死亡率的特点，临床症状主要表现为慢性干咳、发热以及食欲不振等。猪肺炎支原体的感染会抑制宿主免疫系统，极易引发继发性感染，常见的继发性感染病原体包括猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2, PCV2)，猪繁殖和呼吸道综合病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)等，多种病原体之间的相互作用，严重恶化了单一病原体感染的症状，继而引起呼吸系统疾病综合症 (Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)，给全球养猪业造成巨大的经济损失。
[0003]如何快速有效地检测Mhp的感染对猪场有效防控该病具有极其重要的意义。病原分离是鉴定Mhp感染的金标准，但其不能作为临床检测应用。随着PCR技术的不断发展，如实时荧光定量PCR技术、套式PCR技术、基因芯片、环介导等温扩增技术等在疾病诊断方面被逐步建立起来，但这些技术均因设备依赖性高或检测特异性低等难以满足临床快速且经济的检测需求。Piepenburg等于2006年报道了一种重组酶聚合酶（Recombinase polymerase amplification, RPA）扩增技术[1]，可在常温恒温条件下快速进行核酸的扩增。nfo
‑
RPA是在反应体系中添加了nfo酶（大肠埃希菌核酸内切酶Ⅳ）。通过特异性地引物和探针，使nfo
‑
RPA的扩增产物同时携带FAM和Biotin标记，结合侧流层析试纸条，扩增产物通过抗原抗抗体结合的作用在试纸条上显色，无需依赖特殊设备即可实现临床上快速、特异且可视化的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供具有检测特异性高、重复性好、反应结果可以快速通过胶体金试纸条呈现，可应用于临床快检等技术特点的一种猪肺炎支原体nfo
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RPA检测试剂盒。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供一种猪肺炎支原体nfo
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RPA检测试剂盒的制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒，包括用于nfo
‑
RPA酶扩增的引物Mhp
‑
specific
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Forward和Mhp
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specific
‑
Reverse，与P36基因特异性结合的探针Mhp
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specific
‑
Probe，P36阳性质粒，试纸条。
[0007]优选的，所述P36阳性质粒序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选的，所述Mhp
‑
specific
‑
Forward序列为CCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAAC；
所述Mhp
‑
specific
‑
Reverse序列为[Biotin] TGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATG；所述Mhp
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specific
‑
Probe序列为[FAM]GGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCAT[THF]CTTTTAGATCTTTATA[SpC]。
[0009]本专利技术一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：步骤一：猪肺炎支原体的培养；步骤二：P36阳性质粒的制备：通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒；步骤三：Mhp nfo
‑
RPA反应体系的建立：以P36保守序列为模板，分别设计P36
‑
Forward和P36
‑
Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo
‑
RPA酶扩增的引物Mhp
‑
specific
‑
Forward和Mhp
‑
specific
‑
Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp
‑
specific
‑
Probe，将引物、探针、nfo
‑
RPA酶混合建立反应体系，获得Mhp nfo
‑
RPA反应体系。
[0010]优选的，还包括Mhp nfo
‑
RPA反应体系及条件优化，其包括如下步骤：选取稀释浓度为2
×
108 copies/μL的P36质粒模板，分别设置多个时间梯度进行nfo
‑
RPA扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，验筛可见清晰的扩增条带对应的最佳反应时间；在上述筛选出最佳反应时间的基础上，进一步设置多个温度梯度进行nfo
‑
RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，确定最佳反应温度。
[0011]优选的，还包括Mhp nfo
‑
RPA反应体系灵敏度验证，其包括如下步骤：以P36阳性质粒标准品2
×
109 copies/μL为初始浓度，按10倍梯度稀释，在最佳反应时间和最佳反应温度条件下分别以稀释浓度为2
×
109 copies/μL、2
×
108 copies/μL、2
×
107 copies/μL、2
×
106 copies/μL、2
×
105copies/μL、2
×
104 copies/μL、2
×
103 copies/μL、2
×
102 copies/μL、2
×
101 copies/μL、2
×
100 copies/μL的P36阳性质粒为模板，ddH2O为阴性对照进行nfo
‑
RPA扩增反应，并在胶体金本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒，其特征在于：包括用于nfo
‑
RPA酶扩增的引物Mhp
‑
specific
‑
Forward和Mhp
‑
specific
‑
Reverse，与P36基因特异性结合的探针Mhp
‑
specific
‑
Probe，P36阳性质粒，试纸条。2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒，其特征在于：所述P36阳性质粒序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒，其特征在于：所述Mhp
‑
specific
‑
Forward序列为CCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAAC；所述Mhp
‑
specific
‑
Reverse序列为[Biotin] TGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATG；所述Mhp
‑
specific
‑
Probe序列为[FAM]GGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCAT[THF]CTTTTAGATCTTTATA[SpC]。4.一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：步骤一：猪肺炎支原体的培养；步骤二：P36阳性质粒的制备：通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列，从Mhp基因组中扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36阳性质粒；步骤三：Mhp nfo
‑
RPA反应体系的建立：以P36保守序列为模板，分别设计P36
‑
Forward和P36
‑
Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列，根据P36基因的序列分别设计用于nfo
‑
RPA酶扩增的引物Mhp
‑
specific
‑
Forward和Mhp
‑
specific
‑
Reverse，以及与P36基因特异性结合的探针Mhp
‑
specific
‑
Probe，将引物、探针、nfo
‑
RPA酶混合建立反应体系，获得Mhp nfo
‑
RPA反应体系。5.根据权利要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo
‑
RPA反应体系及条件优化，其包括如下步骤：选取稀释浓度为2
×
10
8 copies/μL的P36质粒模板，分别设置多个时间梯度进行nfo
‑
RPA扩增反应，待反应结束后，取出反应管置于冰上结束反应，并在胶体金试纸条中观察结果，验筛可见清晰的扩增条带对应的最佳反应时间；在上述筛选出最佳反应时间的基础上，进一步设置多个温度梯度进行nfo
‑
RPA扩增反应，并在胶体金试纸条中观察结果，确定最佳反应温度。6.根据权利要求5所述的一种猪肺炎支原体nfo
‑
RPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括Mhp nfo
‑
RPA反应体系灵敏度验证，其包括如下步骤：以P36阳性质粒标准品2
×
10
9 copies/μL为初始浓度，按10倍梯度稀释，在最佳反应时间和最佳反应温度条件下分别以稀释浓度为2
×
10
9 copies/μL、2
×
10
8 copies/μL、2
×
10
7 copies/μL、2
×
10
6 copies/μL、2
×
105copies/μL、2
×
10
4 copies/μL、2
×
10

【专利技术属性】
技术研发人员：何玉龙，卢科，舒建洪，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：