基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及快速检测方法技术

本发明专利技术公开了基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及快速检测方法。本发明专利技术通过比较亚洲炭疽菌(Colletotrichum asianum)和其他种炭疽菌基因组的方法所得到的亚洲炭疽菌的特异性分子靶标序列SEQ ID NO.1，针对该序列设计了检测引物对。该检测引物对特异性好、稳定强、灵敏度高，达到10pg/ul。能快速、准确地检测出亚洲炭疽菌。本发明专利技术可为亚洲炭疽菌(Colletotrichum asianum)的快速检测以及该菌引起的病害的监测预警提供了很好的工具。菌引起的病害的监测预警提供了很好的工具。

【技术实现步骤摘要】
基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及快速检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一组基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及快速检测方法。

技术介绍

[0002]亚洲炭疽菌(Colletotrichum asianum)是属于胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)复合种里的一个种。亚洲炭疽菌是一种世界性范围的植物病原菌，在亚洲、美洲以及非洲广泛分布，可对多种植物寄主如芒果、咖啡、辣椒、鳄梨等造成严重的果实或叶片炭疽病，从而导致农作物严重减产，给农民带来巨大经济损失。
[0003]芒果是世界上最重要的热带经济水果之一，据联合国粮农组织(FAO)统计，现有103个国家生产芒果。截至2018年，103个芒果生产国和地区的芒果收获面积约为575万公顷，年产量约为5538万吨。据先前的报道，在中国南方、墨西哥以及巴西等芒果主产区，亚洲炭疽菌是芒果炭疽病的主要病原菌，目前，国内外针对亚洲炭疽菌的快速检测方法未见报道。传统的鉴定亚洲炭疽菌的方法主要是通过形态学鉴定结合多基因系统发育分析，传统的方法耗时耗力。因此，寻找新的亚洲炭疽菌特异性检测靶标尤为重要。
[0004]生物信息学技术的发展为寻找亚洲炭疽菌特异性检测靶标有着重要的启发，可以通过比较基因组的方法来筛选亚洲炭疽菌的特异序列。随着扩增测序技术的不断进步和优化，通过PCR来检测特异序列的成本和时间大大降低。因此，寻找亚洲炭疽菌的特异序列以及快速检测方法将有利于由亚洲炭疽菌引起的炭疽病的监测预警和防控。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，提供一组基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及快速检测方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]利用MUMmer软件对亚洲炭疽菌及不同种炭疽菌之间的基因组序列进行两两比对得到亚洲炭疽菌中含有的特异序列片段，如SEQ ID NO.1所示；该片段可作为鉴定亚洲炭疽菌的特异性新分子靶标。通过检测待测物中是否含有该序列即可确定该待测物是否含有亚洲炭疽菌。
[0008]利用常规引物设计软件遵循引物设计原则基于如SEQ ID NO.1所示特异性分子靶标序列设计亚洲炭疽菌PCR检测引物。
[0009]亚洲炭疽菌(Colletotrichum asianum)特异序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]根据上述特异性检测靶标设计的PCR检测引物对，如下所示：
[0011]caf1：5
’‑
CCGTCAGACGGAATTATCAGC
‑3’
；
[0012]car1：5
’‑
CCGATCCTGTCTTTGAAATGG
‑3’
。
[0013]亚洲炭疽菌的快速PCR检测方法，步骤如下：
[0014]S1：使用上述引物对对待测物DNA进行PCR扩增；
[0015]S2：用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增产物；
[0016]S3：观察扩增产物的条带大小是否为419bp。
[0017]步骤S1中的PCR扩增，其PCR扩增体系为：Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0plus dye)12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，最后加灭菌双蒸水至25μL。
[0018]步骤S1中的PCR扩增，其PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s；60℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共31个循环；最后72℃延伸7min。
[0019]本专利技术公开了一种用于鉴定亚洲炭疽菌的特异序列，相关的PCR检测引物以及对应的PCR检测方法。与传统的亚洲炭疽菌鉴定方法相比，本专利技术具有以下优点：
[0020]通过比较基因组的方法找到亚洲炭疽菌的特异性分子检测靶标序列并设计引物，该引物具有特异性好、稳定性强、灵敏度高的优点，同时，本专利技术的检测方法操作简单、检测耗时短且检测结果容易判定，可为亚洲炭疽菌的鉴定、快速检测提供更好的方案，并有望成为监测亚洲炭疽菌所致病害的工具。
附图说明
[0021]图1为使用引物caf1/car1针对亚洲炭疽菌特异性分子靶标SEQ ID NO.1的特异性检测胶图，其中泳道M：DL2000 Marker；泳道1，16，40，57为测全基因组的亚洲炭疽菌YN55
‑
1的阳性对照；泳道15，39，56，71为双蒸水阴性对照；泳道2
‑
14为其他种炭疽菌，泳道17
‑
38，41
‑
55为其他真菌，泳道58
‑
70为细菌。
[0022]图2为使用引物caf1/car1针对亚洲炭疽菌特异性分子靶标SEQ ID NO.1的稳定性检测胶图，其中泳道M：DL2000 Marker，泳道1为测全基因组的亚洲炭疽菌YN55
‑
1的阳性对照，泳道2
‑
38为本实验室从芒果上分离鉴定的亚洲炭疽菌，泳道39为双蒸水阴性对照。
[0023]图3为使用引物caf1/car1针对亚洲炭疽菌特异性分子靶标SEQ ID NO.1的灵敏度检测胶图，其中泳道M：DL2000 Marker，泳道1
‑
9分别为10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul、100ag/ul的测全基因组的亚洲炭疽菌YN55
‑
1的DNA，泳道10为双蒸水阴性对照。
具体实施方式
[0024]下面将结合具体实施例及附图对本专利技术进行清晰、完整的说明。
[0025]下面所用生物材料本申请人的实验室中均有保存，可以对外公开发放。
[0026]实施例1亚洲炭疽菌的特异性分子靶标的获取
[0027]通过对本实验室的亚洲炭疽菌YN55
‑
1及不同种炭疽菌的全基因组DNA序列进行两两比对，进行生物信息学分析，筛选得到亚洲炭疽菌的特异性分子靶标序列，所述特异性分子靶标序列具体如下：
[0028]CCGTCAGACGGAATTATCAGCCTGGCACTGCCATACATCCCCGTTACTGGGGACCAAAGTTTTGTCAAGCTGAGTAACCCCGTGTGGTCAGTAAAGGTCATGATAATAGTCATCAAACCAAGAATGAAGACCGCGGTCATAACTTACAGGTTTGAAATTGTGCTCTTTAGGTTGCCAGCCAAAGATGTCGGGGACCTGCGCTTTGGCAATCAAAGACATGCCGGCGTCGACACCATATCCAAATCCACAGTCGAGGTTCGAGTTGGCCCTCATTCGTACCCAACCATCACAAACAAGTTCTACATCGGTTGTGGCAACACTCCAAATGTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.亚洲炭疽菌(Colletotrichum asianum)特异序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的特异序列而设计的PCR检测引物对，如下所示：caf1：5
’‑
CCGTCAGACGGAATTATCAGC
‑3’
；car1：5
’‑
CCGATCCTGTCTTTGAAATGG
‑3’
。3.一种亚洲炭疽菌(Colletotrichum asianum)的快速PCR检测方法，步骤如下：S1：使用引物对对待测物DNA进行PCR扩增；S2：用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增产物；S3：观察扩增产物的条带大小是否为419bp；所述引物对为：caf1：5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李其利，鲁萌萌，唐利华，黄穗萍，陈小林，马立安，郭堂勋，莫贱友，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：