用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针、引物组及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针组、引物组，同时提供了利用上述探针组和引物组进行高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的方法。本发明专利技术能快速准确鉴定出RT027/ST1型高产毒艰难类梭菌，还能初步鉴定出非027型高产毒艰难类梭菌及其他产毒型艰难类梭菌，对CDI的临床诊断有重要意义。对CDI的临床诊断有重要意义。对CDI的临床诊断有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针、引物组及方法


[0001]本专利技术涉及一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针、引物组及方法。

技术介绍

[0002]艰难类梭菌（Clostridioides difficile，C. difficile）是一种革兰染色阳性，能产生芽孢的专性厌氧菌。C. difficile是医院抗生素相关性腹泻（Antibiotic
‑
associated diarrhea，AAD）的主要病原菌，可以导致轻到重度的腹泻、结肠炎、伪膜性肠炎、中毒性巨结肠等，严重者甚至可导致死亡。
[0003]近年来，国内外艰难类梭菌感染（Clostridiodes difficile infection，CDI）的发病率和死亡率逐渐增高，每年致全球数万人死亡，治疗费用高达数十亿美元。2013年和2019年，美国CDC（Center for Disease Control and Prevention）将艰难类梭菌感染列为“微生物导致公共健康威胁”的紧迫级病原菌。艰难类梭菌致病在很大程度上归因于这两种毒素——肠毒素A（TcdA）和细胞毒素B（TcdB）。CDI的主要发病过程是通过芽孢经粪
‑
口途径进入人体定植在结肠，当长期使用广谱抗生素或质子泵抑制剂等导致肠道菌群失衡后，艰难类梭菌大量繁殖产生TcdA和TcdB，破坏肠道细胞骨架，使得细胞通透性增高，最终导致腹泻等疾病症状。除此之外，近年来艰难类梭菌高产毒株NAP1/RT027/B1在欧美多个国家暴发流行，其不仅产生TcdA和TcdB，还可以产生二元毒素（cdtA和cdtB），导致CDI的发病率和病死率均大幅增高，引起了全社会对CDI的广泛关注。
[0004]CDI的快速而准确的诊断，对指导治疗和阻止病原菌的传播至关重要。目前，针对不同的检测目标，CDI的实验室检测方法有多种。检测粪便中的游离毒素的方法有酶免疫测定法（EIA）和粪便细胞毒性测定法（CTA）；测定艰难类梭菌的特异抗原有EIA方法测谷氨酸脱氢酶（GDH）；检测产毒艰难类梭菌菌株的方法有产毒艰难类梭菌培养（TC）和核酸扩增试验（NAAT）。其中，粪便CTA和TC分别是检测毒素或有毒菌株的金标准，但是由于技术问题和检测时间过长，这两种方法都没有得到常规使用。NAAT方法是基于实时荧光PCR、环介导等温扩增技术或微阵列技术等分子检测技术进行的艰难类梭菌检测。NAATs检测的靶基因种类很多，包括tcdB、tcdA以及tcdC基因（将
∆
117作为高产毒株RT027/ST1流行毒株的标记）或二元毒素（cdtA/B）基因。NAATs方法非常敏感（平均敏感性为96%（95% CI = 0.93
‑
0.98）），具有较高的阴性预测值。而且，其检测速度较快，可以在一小时内得到结果，因此常把它作为CDI筛选试验。然而，NAATs方法仍存在潜在问题，如由于基因变异，tcdB或 tcdA基因片段可能导致假阴性。而使用tcdC（
∆
117）作为对高产毒株RT027/ST1型艰难类梭菌的特异性检测位点，也存在一定争议。市场现有的RT027/ST1型高产毒艰难类梭菌诊断试剂盒费用相对较为昂贵，不适用于临床CDI的大规模筛查或实验室的大批量艰难类梭菌检测。因此，针对RT027/ST1高产毒艰难类梭菌特异基因序列设计新的引物和探针，开发准确快速、经济适用的高产毒株RT027/ST1型艰难类梭菌检测试剂盒对我国CDI的防治有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针组、引物组，同时提供了利用上述探针组和引物组进行高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的方法。
[0006]本专利技术采用如下技术方案一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针组，其包括pilW基因探针、二元毒素B基因探针、毒素B基因探针以及热休克蛋白基因探针；所述pilW基因探针的序列如SEQIDNo.1所示；所述二元毒素B基因探针的序列如SEQIDNo.2所示；所述毒素B基因探针的序列如SEQIDNo.3所示；所述热休克蛋白基因探针的序列如SEQIDNo.4所示。
[0007]一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的引物组，其包括扩增pilW基因的引物对1F/R、扩增二元毒素B基因的引物对2F/R、扩增毒素B基因引物对3F/R以及扩增热休克蛋白基因的引物对4F/R；所述引物对1F/R的序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；所述引物对2F/R的序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述引物对3F/R的序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；所述引物对4F/R的序列如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示。
[0008]一种包含上述探针组和/或引物组进行高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的试剂盒。
[0009]一种利用上述探针组和引物组进行高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的方法，利用四重实时荧光定量PCR检测pilW基因、二元毒素B基因、毒素B基因以及热休克蛋白基因的保守区域，快速鉴定高产毒艰难类梭菌并分析菌株的毒力情况。
[0010]高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的方法中，（a）若pilW基因、二元毒素B基因、毒素B基因以及热休克蛋白基因均为阳性表示检出RT027/ST1型高产毒艰难类梭菌；（b）若二元毒素B基因、毒素B基因以及热休克蛋白基因均为阳性而pilW基因为阴性表示检出非027型高产毒菌株；（c）若仅有毒素B基因以及热休克蛋白基因为阳性，表示检出产毒型艰难类梭菌；（d）若仅有热休克蛋白基因阳性表示检出非产毒型艰难类梭菌。
[0011]高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的方法具体包括如下步骤：（I）用四重实时荧光定量PCR法对上述提取的DNA进行pilW基因、二元毒素B基因、毒素B基因以及热休克蛋白基因检测；（II）结果判读。
[0012]进一步的，其还包括标本处理步骤：（1）向待检粪便标本中加入无水乙醇，静置1h后3200r/min离心15min，离心结束后弃去标本中的无水乙醇，用灭菌接种环挑取试管底部粪便标本三区划线接种于CDMN平板，37℃厌氧培养36
‑
48h；（2）挑取上述CDMN平板上长出的典型艰难类梭菌菌落涂片革兰染色镜检，鉴定为艰难类梭菌后挑取单菌落于强化布氏血琼脂上传代培养，37℃厌氧培养36
‑
48h；（3）将强化布氏血琼脂平板上的菌落进行DNA提取。
[0013]进一步的，步骤（1）中，粪便和无水乙醇的比例为1∶1。
[0014]进一步的，步骤（3）中，将强化布氏血琼脂平板上的菌落尽数刮进无菌水中，按照细菌DNA提取试剂盒说明进行DNA提取。
[0015]进一步的，步骤（I）中，四重实时荧光定量PCR法的反应总体系为20μL，包括 Premix Ex Taq
TM
10μL，上、下游引物及探针各0.2μL，ddH2O 5.6μL，模板DNA 2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针组，其特征在于，包括pilW基因探针、二元毒素B基因探针、毒素B基因探针以及热休克蛋白基因探针；所述pilW基因探针的序列如SEQIDNo.1所示；所述二元毒素B基因探针的序列如SEQIDNo.2所示；所述毒素B基因探针的序列如SEQIDNo.3所示；所述热休克蛋白基因探针的序列如SEQIDNo.4所示。2.一种用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的引物组，其特征在于，其包括扩增pilW基因的引物对1F/R、扩增二元毒素B基因的引物对2F/R、扩增毒素B基因引物对3F/R以及扩增热休克蛋白基因的引物对4F/R；所述引物对1F/R的序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；所述引物对2F/R的序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；所述引物对3F/R的序列如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；所述引物对4F/R的序列如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示。3.一种包含如权利要求1所述的探针组和/或权利要求2所述的引物组进行高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵建宏，李志荣，欧阳紫柔，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：