【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医疗检测，尤其涉及一种基于crispr-cas恒温检测猴痘病毒的试剂盒及方法。
技术介绍
1、猴痘病毒（mpxv）近年来从中非和西非开始传播到未受感染的流行地区。猴痘是由猴痘病毒（mpxv）引起的病毒性人畜共患疾病，临床表现与天花相似，但表现为较轻的形式，人类致死率较低（1%至10%）。mpxv属于正痘病毒属，是已知最大的包膜双链dna病毒，它被细分为两个分支：西非和刚果盆地分支。在这种情况下，mpxv的快速，特异性和超灵敏检测对于遏制其传播至关重要。
2、由于其高灵敏度和特异性，以实时荧光定量pcr为金标准建立了几种用于检测mpxv的诊断方法。要使用此诊断工具，需要设备齐全的实验室和专业技术人员，这在发生mpxv感染的地区较难实现。因此，急需一种易于操作的简单分子诊断方法来改善mpxv的检测和监测。等温扩增方法已被证明是实时荧光定量pcr的替代方法。基于crisrp-cas系统的4ts（4 thermostatic system）恒温检测系统是一种在恒温下完成恒温提取核酸，恒温扩增序列，恒温剪切靶标，恒温检测片段的技术，通过提供便捷、快速、廉价、高敏感和特异的方法，而无需复杂设备及操作的要求，从而使疾病的诊断更容易获得。但目前该技术存在如下缺陷：
3、1.检测指标qpcr等假阴性率高，需要专业的技术人员和昂贵的实验设备，可能会导致确诊延迟。
4、2.常规核酸提取需借助仪器操作，成本高，工艺复杂，限制了其在核酸快速检测中得到更实际有效的应用。
5、3.常规扩增技术耗时
6、4.目前整个病毒检测流程耗时长，成本高，操作复杂，在疫情反复情况下造成医务人员大规模检测压力，增加社会人力资源负担。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于crispr-cas恒温检测猴痘病毒的试剂盒及方法。本专利技术开发的基于crispr-cas恒温检测猴痘病毒的试剂盒，针对猴痘病毒的迅速传播提供了快速筛查方法，具有极强的临床应用价值，可实现猴痘病毒的有效检测，提高灵敏度、准确性，协助医务人员快速筛查，节省人力和经济资源，整个体系在常温条件下进行，实现了全程恒温操作，突破传统检测方法对温度的要求，为病原微生物检测领域提供了全新的检测方法。
2、第一方面，本专利技术实施提供了基于crispr-cas恒温检测猴痘病毒的试剂盒，包括：恒温核酸提取裂解液、tsa冻干粉、a buffer、双基因靶标b6r和f3l阳性标准品、cas12冻干粉、b buffer及胶体金试纸条。
3、可选的，其中，所述双基因靶标b6r和f3l阳性标准品的浓度为1×108 copies/ml，b6r基因和f3l基因的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
4、可选的，其中，a buffer由50 mm tris、100 mm醋酸钾、5% peg35k、10um上游引物f和10um下游引物r、280 mm醋酸镁、ddh2o组成。
5、可选的，其中，所述引物f和所述引物r是针对猴痘保守基因b6r基因和f3l基因特异性设计的恒温扩增序列，针对b6r基因设计的所述引物f和所述引物r的序列分别如seqid no.3和seq id no.4所示，针对f3l基因设计的所述引物f和所述引物r的序列分别如seqid no.5和seq id no.6所示。
6、可选的，其中，cas12冻干粉包括2ul 1um lbacas12蛋白和2um荧光报告基因。
7、可选的，其中，所述lbacas12替换为mbcas12a、mb3cas12a、fncas12a、ascas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a和bocas12a中的任意一种。
8、可选的，其中，b buffer由5 mm mgcl2、50mm nacl、500nm crrna、10mm tris-hcl、0.1mg/ml bsa组成。
9、可选的，其中，所述crrna遵循tttn的pam原理设计，长度20nt，b6r基因的crrna序列和f3l基因的crrna序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示。
10、可选的，其中，所述荧光报告基因的5’端修饰fam荧光基团，3’端连接猝灭基团或biotin生物素，荧光报告基因序列为：5’-fam-ttaattt-bhq(bio)-3’。
11、第二方面，本专利技术实施例提供了基于crispr-cas恒温检测猴痘病毒的方法，包括如下步骤：
12、1）恒温提取猴痘样本的核酸；
13、2）采用第一方面所述的试剂盒所配置的恒温扩增反应体系对步骤1）提取的核酸进行tsa恒温扩增；
14、3）利用所述tsa恒温扩增后得到的扩增目的片段序列对靶标进行恒温剪切，并进行pcr荧光强度测定，根据测定的荧光值判定核酸检测的阴阳性；
15、4）利用胶体金试纸条对步骤3）的检测结果进行验证。
16、本专利技术的优点和积极效果是：
17、1.本专利技术的检测试剂盒可以更快、更高效的识别猴痘病毒的特异性序列，达到快速诊断的目的；具有极强的临床应用价值，可实现猴痘病毒的有效检测，提高灵敏度、准确性，协助医务人员快速筛查，节省人力和经济资源。
18、2.恒温提取核酸，与传统核酸提取方法的高温要求相比，仪器配置要求低，操作简便；
19、3.恒温扩增序列，tsa法基于pcr原理，在37℃即可扩增目标序列，与现有qpcr方法相比，保持高灵敏度和特异性的同时，温控要求低，气溶胶交叉污染风险低，时间更快；
20、4.恒温剪切靶标，基于crispr-cas12的先天基因剪切特点，构建特异性的crrna和荧光报告基因，结合恒温扩增技术可以更快、更高效的识别猴痘病毒的特异性序列，达到快速诊断的目的；
21、5.恒温检测片段，采用横向侧流试纸条，利用胶体金技术和特异设计的ssdna报告基因的fam基团和生物素，在短时间内获得检测结果。
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1.基于CRISPR-Cas恒温检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，包括：恒温核酸提取裂解液、TSA冻干粉、A buffer、双基因靶标B6R和F3L阳性标准品、Cas12冻干粉、B buffer及胶体金试纸条。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述双基因靶标B6R和F3L阳性标准品的浓度为1×108 copies/ml，B6R基因和F3L基因的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，A buffer由50 mM Tris、100 mM醋酸钾、5%PEG35K、10uM上游引物F和10uM下游引物R、280 mM醋酸镁、ddH2O组成。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物F和所述引物R是针对猴痘保守基因B6R基因和F3L基因特异性设计的恒温扩增序列，针对B6R基因设计的所述引物F和所述引物R的序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，针对F3L基因设计的所述引物F和所述引物R的序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，Cas12冻干粉包括2ul 1uM LbaCas12蛋白和2uM荧光报告基因。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其中，所述LbaCas12替换为MbCas12a、Mb3Cas12a、FnCas12a、AsCas12a、Lb5Cas12a、HKCas12a、OsCas12a、TsCas12a和BoCas12a中的任意一种。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，B buffer由5 mM MgCl2、50mM NaCl、500nMcrRNA、10mM Tris-HCl、0.1mg/ml BSA组成。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA遵循TTTN的PAM原理设计，长度20nt，B6R基因的crRNA序列和F3L基因的crRNA序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
9.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基因的5’端修饰FAM荧光基团，3’端连接猝灭基团或biotin生物素，荧光报告基因序列为：5’-FAM-TTAATTT-BHQ(Bio)-3’。
10.基于CRISPR-Cas恒温检测猴痘病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.基于crispr-cas恒温检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，包括：恒温核酸提取裂解液、tsa冻干粉、a buffer、双基因靶标b6r和f3l阳性标准品、cas12冻干粉、b buffer及胶体金试纸条。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述双基因靶标b6r和f3l阳性标准品的浓度为1×108 copies/ml，b6r基因和f3l基因的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，a buffer由50 mm tris、100 mm醋酸钾、5%peg35k、10um上游引物f和10um下游引物r、280 mm醋酸镁、ddh2o组成。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物f和所述引物r是针对猴痘保守基因b6r基因和f3l基因特异性设计的恒温扩增序列，针对b6r基因设计的所述引物f和所述引物r的序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示，针对f3l基因设计的所述引物f和所述引物r的序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，cas12冻干...
【专利技术属性】
技术研发人员：向天新，张伟，刘洋，龚正华，邓琼，应颖，程娜，康秀华，
申请(专利权)人：深圳市研元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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