【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种来源于corynebacterium sp的腈水解酶的改造，通过多位点的组合突变实现csnit-m3工程菌的构建，利用硅藻土、聚乙烯亚胺-戊二醛复合材料固定化以大肠杆菌为表达宿主细胞的腈水解酶突变体csnit-m3生物制备四氯吡啶甲酸、3-氯苯甲酸、4-氯-2-吡啶甲酸、2，4-二氯苯甲酸的方法，属于生物工程应用。
技术介绍
1、腈水解酶作为生物催化领域中的一种重要催化剂，可用于羧酸合成，且具有反应条件温和，催化效率高，选择性突出，工艺绿色环保等特点。近几年来腈水解酶在生物催化技术方面，尤其是在医药中间体如α-羟基乙酸、(r)-扁桃酸、(r)-3-氯扁桃酸、烟酸及其氯代衍生物3-氯苯甲酸等这几大类化合物的生产中的应用取得了瞩目的成就。
2、含氯的芳香环羧酸类化合物，包括3-氯苯甲酸、四氯吡啶甲酸等因其化学性质稳定、生物结构复杂，被视为工业生产的重要中间体，在农药、药物、染料、纺织品和采矿工业等领域都有应用。目前含氯的芳香环羧酸类化合物在工业上的传统合成途径使用较普遍的一般考虑为化学氧化剂氧化法、气相催化氧化法、液相催化氧化法、氨氧化法等，然而以上传统的合成方法往往存在一些问题，例如反应条件苛刻、步骤复杂、废弃物多等问题，并且能耗较大。
3、传统的酶法催化相较于化学催化来说专一性高，且条件温和，更环保。酶法在催化其他含氯的腈类化合物上已有工业化应用的报道，例如二氯苯腈、二氯氰基吡啶等，四氯氰基吡啶同样作为含氯的腈类化合物，有巨大的工业应用潜力。截止目前尚未报道一种可以高效催化四氯氰基吡啶、
4、由于在大规模的工业化生产中，静息细胞无法回收重复利用，这不仅仅会增加生产成本，而且引入外源蛋白后会给后续的分离纯化造成困难，并且静息细胞的ph稳定性和热稳定性都较差，不利于工产的连续性生产。将静息细胞固定化后，则可以很大程度上提升酶的热稳定性和ph稳定性，而且固定化后的细胞可以回收再利用，可以实现连续化生产同时简化了下游的分离纯化操纵步骤。以上来说，固定化细胞应用于工业化生产有着天然的优越性。
5、本专利技术还发现构建的csnit-m3对某些含有氯元素的芳香环羧酸类化合物具有较高催化活力，例如催化4-氯-2-甲基吡啶、3-氯苯腈和2，4-二氯苯腈水解生成4-氯-2-吡啶甲酸、3-氯苯甲酸和2，4-二氯苯甲酸等有价值化合物，因此可以用于该类产品的生物合成。
技术实现思路
1、本专利技术的目的为了解决现有技术的不足，本专利技术提供一种腈水解酶突变体并对其进行工程菌的构建，通过本专利技术可以解决现有腈水解酶活性不高的问题，并提高了酶的稳定性。
2、为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案如下，一种腈水解酶突变体，所述腈水解酶突变体与氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水解酶相比，进行了以下位点的单突变或组合突变：
3、a.第128位缬氨酸突变变为亮氨酸；
4、b.第180位丝氨酸突变为半胱氨酸；
5、c.第198位苏氨酸突变为甘氨酸。
6、优选的，所述腈水解酶突变体的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、本专利技术提供一种上述腈水解酶突变体的编码基因。
8、将来源于corynebacterium sp的腈水解酶，通过上述本专利技术上述的单点突变或组合突变，得到的腈水解酶突变体，其编码基因也应列入本专利技术的保护范围。
9、本专利技术提供一种携带上述编码基因的重组表达载体。所述重组表达载体可为质粒、噬菌体或病毒载体。
10、重组表达载体是一种用于将外源基因导入到宿主细胞中进行表达的dna分子。基于上述本专利技术提供的腈水解酶突变体核苷酸序列，重组表达载体可通过本领域常规方法将本专利技术的腈水解酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，连接本专利技术的腈水解酶突变体核苷酸序列，均应属于本专利技术的保护范围。具体地，重组表达载体优选pet-28a(+)。
11、本专利技术提供一种携带上述编码基因或上述重组表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
12、将外源基因导入到宿主细胞中进行表达是生物工程中常用的技术手段。将上述编码基因，通过基因工程技术导入宿主细胞进行表达，可以获得本专利技术改造得到的腈水解酶突变体，因此，上述宿主细胞均应列入本专利技术的保护范围。
13、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌。
14、本专利技术的另一个目的是提供一种腈水解酶突变体的应用，通过该腈水解酶突变体制备的催化剂可以高效催化制备含氯芳香环羧酸类化合物。
15、本专利技术提供该腈水解酶突变体，或者其编码基因，或者其重组表达载体，或者其宿主细胞在含氯芳香环羧酸类化合物中的应用。
16、本专利技术还提供了一种制备含氯芳香环羧酸类化合物的方法，包括以下步骤：
17、(1)制备催化剂：往腈水解酶突变体的菌悬液中加入吸附载体，搅拌吸附后，加入聚乙烯亚胺、戊二醛进行交联，得到腈水解酶突变体固定化细胞，即所述催化剂；
18、其中，所述吸附载体选自硅藻土、皂土、海藻酸钠、活性炭；
19、(2)催化反应：以步骤(1)得到的腈水解酶突变体固定化细胞为催化剂，以含氯芳香环羧酸类化合物为底物，催化反应。
20、目前，含氯芳香环羧酸类化合物腈水解反应存在转化率低的问题。本专利技术通过上述步骤(1)～(2)，使用硅藻土、皂土、海藻酸钠、活性炭等吸附材料吸附本专利技术筛选得到的腈水解酶突变体菌体，并进一步使用聚乙烯亚胺、戊二醛共价交联，实现大肠杆菌细胞固定化，得到腈水解酶突变体固定化细胞，以此作为催化剂，催化含氯芳香环羧酸类化合物腈水解反应，发应效率高。同时，本专利技术提供的固定化细胞方法具有回收率高，稳定性好的特点。
21、具体地，制备含氯芳香环羧酸类化合物的方法如下：
22、(1)制备催化剂：将腈水解酶突变体的湿菌体用适量无菌水充分搅拌，获得菌悬液；向搅拌均匀的菌悬液中加入硅藻土等吸附载体，在室温、600～1000rpm条件下水浴搅拌1～8h，再加入聚乙烯亚胺，在室温、600～1000rpm条件下磁力搅拌交联0.5～2h；再加入戊二醛，在室温、800～1000rpm条件下磁力搅拌交联0.5～2h，抽滤，所得滤饼使用无菌水冲洗2～3次，收集后即获得大肠杆菌固定化细胞，即所述催化剂；
23、(2)催化反应：以步骤(1)得到的腈水解酶突变体固定化细胞为催化剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体与氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的腈水解酶相比，进行了以下位点的单突变或组合突变：
2.根据权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.编码权利要求1所述腈水解酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。
6.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌。
9.权利要求1所述腈水解酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4～5任一项所述重组表达载体，或权利要求6～8任一项所述宿主细胞在制备含氯芳香环羧酸类化合物中的应用。
10.一种权利要求9所述的应用，其特征在于：所
...【技术特征摘要】
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体与氨基酸序列如seq idno.2所示的腈水解酶相比，进行了以下位点的单突变或组合突变：
2.根据权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.编码权利要求1所述腈水解酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为质粒、噬菌体或病毒载体。
6.携带权...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，沈子园，沈其，程峰，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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