一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组载体及其在构建无外源基因的转基因玉米中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组载体及其在构建无外源基因的转基因玉米中的应用，属于玉米生物技术育种技术领域。本发明专利技术以pEGAD载体为骨架载体，Cre/loxP系统中两个特异性识别位点loxP分别位于LB和RB，筛选标记表达框与Cre酶表达框和目标基因表达框插入在两个loxP位点之间；目标基因表达框为植物基因启动子驱动的靶基因；筛选标记表达框为标记蛋白基因和除草剂抗性基因形成的融合基因；Cre酶表达框为胚乳特异性表达启动子驱动的重组酶基因Cre。以玉米胚性愈伤组织为受体材料，构建一种胚乳中无外源基因的转基因玉米。利用重组表达载体实现了转基因成分在胚乳中精确剔除的转基因。中精确剔除的转基因。中精确剔除的转基因。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组载体及其在构建无外源基因的转基因玉米中的应用


[0001]本专利技术属于玉米生物技术育种
，具体涉及一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组载体及其在构建无外源基因的转基因玉米中的应用。

技术介绍

[0002]玉米(Zea mays L.)是世界上最重要的农作物之一，作为世界上众多地区的粮食作物和大部分地区的主要饲料作物，在全世界广泛种植。同时玉米也是重要的工业原料，被广泛用于发酵工业、酒精制造和提供生物能源。玉米的育种改良和农业生产是影响我国粮食安全的重要因素。近几十年，随着诱变育种技术、转基因技术、双单倍体技术和分子标记辅助选择技术等育种新技术在商业育种中的逐步完善和推广应用，玉米育种逐渐形成了常规育种向分子育种、经验育种向精确育种过渡的趋势。
[0003]自从世界上首例转基因植物(烟草)问世，利用转基因技术培育作物新品种已经成为重要的育种手段。理论上讲，转基因技术是通过目标基因的交流实现的，与传统育种技术没有本质区别，而且在技术上，转基因育种技术改良的遗传信息更清楚、更明确、更具体，选择效率高。成功克服了远缘杂交不亲和的困难，将优良的基因导入到受体物种中，实现了育种性状的定向改变，有效地打破了物种间生殖隔离的障碍，丰富了材料的多样性。在实际生产中，实现了减少玉米产量损失和农药化肥使用量的目标，带来了巨大的社会、经济和生态效益。
[0004]随着转基因技术的发展，筛选标记的优化一直是发展高效的转化系统的一个重要组成部分。有效的筛选将转化细胞从未转化细胞中分离出来，是转基因系统的最关键的部分之一，选择标记的存在提高了转基因的效率。一旦转基因操作完成，使用的筛选标记在转基因材料应用中往往没有应用价值。这些筛选标记持续稳定地表达不利于对该材料进行更多基因的转化(可以选用的筛选标记太少)，而且会引起公众对筛选标记安全性和环境保护方面的担忧。一些人认为转基因植株中存在一些具有抗生素抗性的标记基因，可能在动物的肠道中转移给微生物，产生难以用抗生素抵抗的“超级微生物”，从而影响抗生素的治疗效果。更多的研究则表明转基因植物的基因具有通过基因漂移转移到近缘的非转基因植物的可能，引起近缘物种获得潜在的选择优势，产生抗虫、抗病或抗除草剂的所谓“超级杂草”。为了在成功进行转基因筛选的同时避免或者解决筛选标记带来了负面影响，选用新型的相对安全的筛选标记和筛选标记的剔除等技术策略，为安全转基因应用提供了有效途径。
[0005]现在研究中，使用的安全筛选标记还有糖代谢相关基因、抗逆相关基因和形态学相关基因。这些筛选标记的使用，降低了转基因植株的潜在风险。随着人们对转基因安全意识的提高，开发新型更安全的筛选标记以及筛选标记的剔除仍是植物转基因研究的重要方向。目前，已开发的转基因标记基因删除技术有共转化法、表达盒转化法、位点特异重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术、转座子法和染色体同源重组法等。位点特异性
重组系统由重组酶和重组位点两部分组成，在重组酶的催化和参与下通过小范围内同源序列的联会产生重组，剔除重组位点间的筛选标记获得无标记的转基因植株。Onouchi等利用此方法成功获得了筛选标记基因剔除而只含有目的基因的转基因拟南芥植株。
[0006]Cre/loxP重组系统是目前应用最广泛的位点特异性重组系统，由Cre重组酶和其特异性识别位点loxP组成。将筛选标记插入到两个同向的loxP位点之间，利用Cre重组酶激活两个loxP位点之间发生重组删除两个lox位点间的标记基因。Cre重组酶识别loxP序列时有着简单高效的优势，整个过程不需要辅助因子的帮助和额外能量的供应，即可介导重组事件的发生，删除两个loxP位点间的DNA片段(图1)。
[0007]Cre重组酶的活性直接决定着重组效率的高低，对整个Cre/loxP系统的重组起到至关重要的作用。根据应用的方式不同，可以将Cre/loxP位点特异性重组系统的剔除方式分为简单删除、控制删除和高效删除。简单删除是指将标记基因整合在两个同向loxP位点间构建成载体进行转化，重组酶Cre基因则通过有性杂交或二次转化的方法引入到携带有筛选标记的转基因植株中。虽然Cre/loxP位点特异性重组系统在植物转化中实现了筛选标记的剔除，但是这种方法的操作比较繁琐，此外，重组酶在转基因植株中的表达有时候也会引起植株表型的变异。
[0008]为了解决简单删除时操作繁琐、重组酶引起受体组织异常等问题，后续的研究中提出了控制删除的操作策略，这个策略是将Cre基因和选择标记基因构建在2个同向的loxP位点间，通过诱导型的启动子驱动Cre重组酶基因的表达，以删除选择标记基因。Gleave等通过瞬时表达转基因烟草中的Cre重组酶，实现了标记基因的删除，通过重组酶的瞬时表达也可删除标记基因，可以避免了再转化和杂交过程。基于这个原理，Hoff等构建了pCrox载体系统：热激启动子GSP81
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1Cre诱导Cre重组酶基因启动，卡那霉素抗性基因Tn903插入到两个loxP位点之间，利用GUS基因作为报告基因，并在拟南芥中成功验证了其功能。Zuo等报道了一个化学诱导表达系统，通过XVE来诱导Cre基因的表达，同样高效率地获得了无选择标记的转基因拟南芥。控制删除的操作策略的优势在于通过诱导启动子可以瞬时的表达Cre重组酶基因，不用担心重组酶提前或者过量表达带来的不利影响，更加高效的进行了标记基因切除工作。然而在激活Cre重组酶时，需要额外的诱导操作，不符合操作简便的要求。高效删除则是指通过增强Cre重组酶和loxP位点识别效率，来提高删除效率。Luo等将loxP和frt两个特异识别位点构成一个新的杂合识别位点lox
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pfrt，通过提高Cre重组酶或Flp的识别结合效率，在T1代转基因烟草中检测到平均删除率为33％
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79％，部分植株中删除率可达100％。虽然该方法有利于提高转基因植株的删除率，但需要额外增加重组载体的识别位点，无形中增加了构建步骤和生产成本。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组载体及其在构建胚乳中无外源基因的转基因玉米中的应用，具有高效准确的剔除效率，并且靶基因的稳定遗传表型。
[0010]本专利技术提供了一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组表达载体，以pEGAD载体为骨架载体，Cre/loxP系统中两个特异性识别位点loxP分别位于LB和RB，筛选标记表达框与Cre酶表达框和目标基因表达框插入在两个loxP位点之间；
[0011]所述目标基因表达框为植物基因启动子驱动的靶基因；
[0012]所述筛选标记表达框为标记蛋白基因和除草剂抗性基因形成的融合基因；
[0013]所述Cre酶表达框为胚乳特异性表达启动子驱动的重组酶基因Cre。
[0014]优选的，所述标记蛋白包括荧光蛋白和藻胆蛋白；
[0015]所述荧光蛋白包括绿色荧光的蛋白及其衍生荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性剔除胚乳中外源基因的重组表达载体，其特征在于，以pEGAD载体为骨架载体，Cre/loxP系统中两个特异性识别位点loxP分别位于LB和RB，筛选标记表达框与Cre酶表达框和目标基因表达框插入在两个loxP位点之间；所述目标基因表达框为植物基因启动子驱动的靶基因；所述筛选标记表达框为标记蛋白基因和除草剂抗性基因形成的融合基因；所述Cre酶表达框为胚乳特异性表达启动子驱动的重组酶基因Cre。2.根据权利要求1所述重组载体，其特征在于，所述标记蛋白包括荧光蛋白和/或藻胆蛋白；优选的，所述荧光蛋白包括绿色荧光的蛋白及其衍生荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。3.根据权利要求1所述重组载体，其特征在于，所述除草剂抗性基因包括抗三氮苯类除草剂的基因、抗乙酰羟酸和酶抑制剂类除草剂的基因、抗草甘膦的基因、抗双丙氨磷的基因；优选的，所述抗双丙氨磷的基因为bar基因。4.根据权利要求1所述重组载体，其特征在于，所述靶基因包括花青素合成基因Rsc或抗逆基因；优选的，所述抗逆基因包括抗虫基因、抗除草剂基因、抗寒基因、抗高温基因和抗旱基因；所述植物基因启动子包括35S启动子、泛素启动子、条件诱导性启动子或组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜邓襄，董国清，曾万勇，李金花，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：