杀昆虫蛋白制造技术

披露了用于控制昆虫有害生物的组合物和方法。特别是，提供了对至少鞘翅目昆虫有害生物具有毒性的新颖杀昆虫蛋白。还提供了编码所述新颖杀昆虫蛋白的核酸分子。还披露了制备所述杀昆虫蛋白的方法和使用所述杀昆虫蛋白以及编码本披露的杀昆虫蛋白的核酸的方法，例如，在转基因植物中以赋予免于昆虫损害的保护。护。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杀昆虫蛋白
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年10月14日提交的美国临时申请号62/914,667的优先权，其内容通过引用以其全文并入本文。
[0003]序列表的引用
[0004]提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37 C.F.R.
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1.821提交的，名称为“81942
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1_ST25.txt”，大小为约113千字节，于2020年9月30日生成并经EFS
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Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。


[0005]本专利技术涉及蛋白工程、植物分子生物学以及有害生物控制的领域。更具体地，本专利技术涉及具有杀昆虫活性的新颖蛋白及其变体，核酸(其表达产生杀昆虫蛋白)，以及制造这些杀昆虫蛋白和相应的核酸的方法和使用这些杀昆虫蛋白和相应的核酸来控制昆虫的方法。

技术介绍

[0006]昆虫有害生物是引起作物损失的一个主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是一种负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是一种令人讨厌的东西。
[0007]玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。单在美国，三个物种，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫)、长角巴氏根萤叶甲(D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫)、以及黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫)，在美国玉米带中，每年对玉米造成的损失超过十亿美元。美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae))。在南美洲，南美叶甲(Diabrotica Speciosa)被认为是玉米的重要有害生物。西方玉米根虫于1992年传播到欧洲，自2008年以来一直在整个主要玉米种植地区造成经济损失。玉米根虫幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成最为实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食还通过为导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了进入根部的途径，而对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，在此它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。
[0008]玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。由此可以达到良好的玉米根虫控制，但这些化学品有时也能影响其他有益的生物。广泛使用化学杀有害生物剂引起的另一个问题是出现抗性昆虫群体。又另一个问题是由于下述事实：玉米根虫幼虫在地下摄食因此使得施用杀昆虫剂的救护处理变得困难。因此，大多数杀昆虫剂的施
用是在种植时预防性地进行的。这种实践导致了巨大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需求。
[0009]生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ
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内毒素(Δ
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内毒素；也被称为结晶毒素或Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，也已经小规模施用至作物植物中，产生了针对某些昆虫有害生物的令人满意的结果。这些δ
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内毒素是在结晶基质内所容纳的蛋白，已知它们当被某些昆虫摄取时拥有杀昆虫活性。来自苏云金芽孢杆菌的此类Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，起始于2003年，通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、或修饰的Cry3A(mCry3A)或eCry3.1Ab蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可商购的。
[0010]尽管已经显示使用表达Cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的Cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型且有效的有害生物控制蛋白，这些有害生物控制蛋白为农民提供经济益处并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(Diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白，与现有昆虫控制产品中的Cry蛋白相比这些蛋白具有不同的作用方式，以缓和抗性发展。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制蛋白是令人希望的。

技术实现思路

[0011]鉴于这些需要，在一些实施例中，本披露提供了特别来源于根瘤菌科细菌，但也可以来源于其他类型的细菌的杀昆虫蛋白。此类杀昆虫蛋白的实例在本文中举例说明并且此类杀昆虫蛋白，无论来源于根瘤菌科还是其他不同细菌，统称为根瘤菌科杀昆虫蛋白(RIP)。本披露还提供了RIP的变体，以及与RIP及其变体基本相同的蛋白。本披露的RIP的氨基酸序列的示例包括但不限于SEQ ID NO:1
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21中的任一个。本披露的RIP对昆虫有害生物具有毒性。例如，本披露的蛋白可用于控制经济上重要的昆虫有害生物，包括鞘翅目昆虫，如西方玉米根虫(WCR；玉米根萤叶甲)、北方玉米根虫(NCR；长角巴氏根萤叶甲)、南方玉米根虫(SCR；黄瓜十一星叶甲食根亚种)和/或墨西哥玉米根虫(MCR；墨西哥玉米根萤叶甲)。
[0012]本披露还提供了核酸分子，所述核酸分子包含一个或多个编码RIP或变体RIP的核苷酸序列、它们的互补序列，或与RIP或RIP变体基本相同的核苷酸序列。编码本披露的RIP或变体RIP的核苷酸序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:22
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49中的任一个
[0013]本披露还提供了包含编码本披露的RIP和/或变体RIP的重组核酸的载体；包括和能够表达这样的核酸的植物或微生物；用这样的核酸转化的植物，例如转基因玉米植物；这样的植物的后代，其含有稳定地掺入和以孟德尔方式遗传的核酸，和/或这样的植物的种子和这样的后代。本披露还提供育种的方法，以将包含本披露的核酸分子的转基因引入子代植物和各种种质中。
[0014]本披露还提供了包含本披露的RIP和/或变体RIP的组合物和配制品，其能够抑制有害生物存活、生长和/或繁殖的能力，或限制与昆虫相关的对作物的损害或损失的能力，例如，将RIP或RIP变体作为组合物或配制品的一部分施用于受昆虫侵染的区域或植物，或预防性处理易受昆虫侵染的区域或植物以赋予对昆虫有害生物的保护。
[0015]本披露进一步提供制造RIP或其变体的方法，以及使用所述核酸的方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。这样的微生物可以是，
例如，定殖玉蜀黍根并将本披露的RIP递送至玉蜀黍根际的内生物种，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸分子，其包含编码对昆虫有害生物有毒的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)编码包含与SEQ ID NO:1
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21中的任一个或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白；或(b)与SEQ ID NO:22
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49中的任一个或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列同一性；或者(c)是(a)或(b)的合成序列，所述合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:1
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21中的任一个或其毒性片段的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:22
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49中的任一个或其毒素编码片段。4.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述合成核苷酸序列包含SEQ ID NO:26
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49中的任一个或其毒素编码片段。5.一种嵌合基因，其包含可操作地连接至如权利要求1
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4中任一项所述的核酸分子的异源启动子。6.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述植物可表达型启动子选自由以下组成的启动子的组：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因9 5'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、稻肌动蛋白、稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S以及S
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E9小亚基RuBP羧化酶启动子。8.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。9.如权利要求8所述的嵌合基因，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。10.如权利要求9所述的嵌合基因，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。11.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述转基因生物是细菌或植物。12.如权利要求11所述的嵌合基因，其中所述转基因细菌选自由以下组成的属的组：芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、土壤杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属和产碱杆菌属。13.如权利要求11所述的嵌合基因，其中所述植物是玉蜀黍植物。14.一种对昆虫有害生物有毒的蛋白，其中所述蛋白包含(a)与SEQ ID NO:1
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21中的任一个或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或(b)包含SEQ ID NO:1
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21中的任一个或其毒素片段的氨基酸序列；或(c)由与SEQ ID NO:21
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49中的任一个或其毒素编码片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(d)由包含SEQ ID NO:21
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49中的任一个或其毒素编码片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(e)(a)
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(d)的氨基酸序列，其包含选自由SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53组成的组的细胞毒素结构域。
15.如权利要求14所述的蛋白，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。16.如权利要求15所述的蛋白，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。17.如权利要求16所述的蛋白，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。18.一种重组载体，其包含如权利要求5所述的嵌合基因。19.一种宿主细胞，其包含如权利要求18所述的重组载体，其中所述宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。20.如权利要求19所述的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、土壤杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。21.如权利要求20所述的转基因芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞是苏云金芽孢杆菌细胞。22.如权利要求19所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。23.如权利要求22所述的转基因植物细胞，其中(a)所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、甜菜细胞以及烟草细胞；或(b)所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。24.一种转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含如权利要求23所述的转基因植物细胞。25.如权利要求24所述的转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分是转基因玉蜀黍植物或植物部分。26.一种工程化的杀昆虫蛋白，所述工程化的杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列与a)SEQ ID NO:1具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1
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345中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变；或与b)SEQ ID NO:2具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置1
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344中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变；或与c)SEQ ID NO:3具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置1
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351中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变；或与d)SEQ ID NO:4具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸位置1
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347中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变。27.如权利要求26所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述突变位于与SEQ ID NO:3的氨基酸位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219或275或其任意组合对应的氨基酸位置处。28.如权利要求27所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述突变位于SEQ ID NO:3的位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219或275处。
29.如权利要求28所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中位置50处的突变为I50L，位置52处的突变为I52L，位置56处的突变为I56L，位置62处的突变为A62C或A62L，位置64处的突变为A64C或A64L，位置81处的突变为I81L，位置126处的突变为I126...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：先正达农作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：