一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法，将CRISPR/Cas9基因编辑技术和其它标签基因联合使用，分别构建OsMYB36a/b/c

【技术实现步骤摘要】
一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]突变体是研究基因功能的重要材料，其获得的方式也在迅速发展。在1927年，通过X射线诱发果蝇和玉米基因突变，以及后来用化学诱变剂和氮芥诱发果蝇的突变等。但是这些突变都是随机的，需要大量的筛选工作才能找到目的基因突变的材料，而且突变多以单碱基的替换为主，严重影响了对特定基因的研究。
[0003]直到1996年，ZFN(锌指核酸酶)的发现，人类对基因编辑开始有了新的认识。可以人为设计特异性识别目标DNA序列的锌指核酸酶，其与目标DNA结合后，FOKI核酸内切酶形成二聚体，将DNA双链切断，引发DNA的修复，造成基因敲除或插入，从而获得目标基因的突变。然而，这种突变的成功率较低，脱靶现象严重。在2011年，对改技术进行了改进，发展出了TALEN(转录激活效应因子核酸酶)技术。通过一对特异性识别DNA序列的蛋白分子TALE(Left TALE和Right TALE)与核酸内切酶FOKI结合，特异性靶向目标基因。然后通过Ⅲ型分泌系统将效应蛋白(TAL effector)输入细胞，并通过核酸内切酶FOKI切割DNA双链，引发DNA的修复，从而达到对基因的重编辑，获得目标基因的突变。但该技术对目标基因的序列特异性要求较高，并且脱靶效率仍然较高。
[0004]在2013年，CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短会问重复序列)技术的出现，给基因编辑技术带来了空前的进步，使人们对基因功能的研究达到了前所未有的热度。该技术主要是通过gRNA(guide RNA)特异性识别目标序列，引导Cas9蛋白酶对DNA双链进行切割，引发DNA修复，造成基因的敲除或插入，使基因发生移码突变。该技术操作方便，打靶效率高，已应用于众多领域的研究。
[0005]但是，在对敲除基因的研究过程中，科研人员常研究它们的上下游基因，以及该基因对其它基因的调控关系和影响。科研人员通常会筛选出不含筛选标记的敲除突变体，再将携带有特殊标记(如GFP、Flag、HA等标记)或其它片段(如：过表达片段等)转入，从而研究突变体对其它基因的影响。该过程不仅复杂、成本较高，而且耗时耗力，严重影响了科研的进度。对于研究多突变体对其它基因的影响时，利用常规的杂交获得不含筛选标记的突变体更加困难。另外，对繁殖周期较长的物种(如树木类)，用常规方法研究多基因之间的关系更加困难。
[0006]水稻OsMYB36a/b/c是与拟南芥AtMYB36最同源的三个基因。同时敲除三个基因可能会影响内皮层凯氏带的形成。然而凯氏带的缺陷会严重影响植株的生长发育，如OsCASP1基因的突变导致水稻长势极差而且结实很少。因此，研究OsMYB36a/b/c突变对凯氏带形成、内皮层极性蛋白的影响，通过传统的方法先筛选不含标记的OsMYB36a/b/c突变体，并得到足够的种子，再将其它带标签的目的基因转入，不但增加研究成本，而且周期很长，并且OsMYB36a/b/c突变体种子的获得十分困难。因此通过本专利技术可以轻松解决以上问题，并为
多基因突变体对其它基因的研究提供有效的方案。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法，包括以下步骤：
[0010]步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体；
[0011]步骤S2，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计水稻的OsMYB36a基因、OsMYB36b基因和OsMYB36c基因的敲除靶点，设计靶点引物，先通过第一轮PCR将三个基因的靶点分别组装到三个不同的载体上，再以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二轮PCR引入接头，分别得到OsMYB36a
‑
sgRNA表达盒A1、OsMYB36b
‑
sgRNA表达盒A2和OsMYB36c
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sgRNA表达盒A3；
[0012]其中，在第一轮PCR扩增中：将OsMYB36a基因靶点组装到pYLsgRNA
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OsU6a/LacZ(GeneBank:KR559260KR029106)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；将OsMYB36b基因靶点组装到pYLsgRNA
‑
OsU6b(GeneBank:KR559260KR029107)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；将OsMYB36c基因靶点组装到pYLsgRNA
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OsU3m/LacZ(GeneBank:KR559260)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；
[0013]其中，在第二轮PCR扩增中：扩增出OsMYB36a
‑
sgRNA表达盒A1的引物组如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示，扩增出OsMYB36b
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sgRNA表达盒A2的引物组如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示，扩增出OsMYB36c
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sgRNA表达盒A3的引物组如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示；
[0014]步骤S3，通过PCR从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出带有待研究基因和表达标签的目的片段，将其作为第四个表达盒；
[0015]步骤S4，如果步骤S3所述的目的片段不含有Bsa
ꢀⅠ
酶切位点，则将步骤S2得到的三个表达盒、步骤S4的第四个表达盒纯合后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi
‑
H进行酶切
‑
连接反应，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体；
[0016]步骤S5，如果步骤S3所述的目的片段含有Bsa
ꢀⅠ
酶切位点，则按照以下步骤操作：
[0017]步骤S51，对步骤S2得到的OsMYB36a
‑
sgRNA表达盒A1、OsMYB36b
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sgRNA2表达盒A和OsMYB36c
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sgRNA表达盒A3进行第三轮PCR，得到OsMYB36a
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sgRNA表达盒B1、OsMYB36b
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sgRNA表达盒B2和OsMYB36c
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sgRNA表达盒B3；
[0018]在第三轮PCR中，扩增出OsMYB36a
‑
sgRNA表达盒B1的引物组如SEQ ID NO.13～SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体；步骤S2，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计水稻的OsMYB36a基因、OsMYB36b基因和OsMYB36c基因的敲除靶点，设计靶点引物，先通过第一轮PCR将三个基因的靶点分别组装到三个不同的载体上，再以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二轮PCR引入接头，分别得到OsMYB36a
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sgRNA表达盒A1、OsMYB36b
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sgRNA表达盒A2和OsMYB36c
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sgRNA表达盒A3；其中，在第一轮PCR扩增中：将OsMYB36a基因靶点组装到pYLsgRNA
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OsU6a/LacZ(GeneBank:KR559260KR029106)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；将OsMYB36b基因靶点组装到pYLsgRNA
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OsU6b(GeneBank:KR559260KR029107)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；将OsMYB36c基因靶点组装到pYLsgRNA
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OsU3m/LacZ(GeneBank:KR559260)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；其中，在第二轮PCR扩增中：扩增出OsMYB36a
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sgRNA表达盒A1的引物组如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示，扩增出OsMYB36b
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sgRNA表达盒A2的引物组如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示，扩增出OsMYB36c
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sgRNA表达盒A3的引物组如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示；步骤S3，通过PCR从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出带有待研究基因和表达标签的目的片段，将其作为第四个表达盒；步骤S4，如果步骤S3所述的目的片段不含有BsaⅠ酶切位点，则将步骤S2得到的三个表达盒、步骤S4的第四个表达盒纯合后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi
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H进行酶切
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连接反应，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体；步骤S5，如果步骤S3所述的目的片段含有BsaⅠ酶切位点，则按照以下步骤操作：步骤S51，对步骤S2得到的OsMYB36a
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sgRNA表达盒A1、OsMYB36b

【专利技术属性】
技术研发人员：夏继星，王志刚，张宝磊，彭丽云，辛亚峰，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：