酸浆类块根体介导的遗传转化方法技术

本发明专利技术属于生物技术与组织培养领域，具体涉及酸浆类块根体介导的遗传转化方法。本发明专利技术可快速、高效诱导酸浆RTB结构，并且以酸浆叶片为转化外植体通过RTB介导的方法成功转化外源基因。所诱导出的RTB结构可离体成苗，成苗率100％；所建立的RTB介导的酸浆遗传转化体系，稳定、高效。高效。高效。

【技术实现步骤摘要】
酸浆类块根体介导的遗传转化方法


[0001]本专利技术属于生物技术与组织培养领域，具体涉及酸浆类块根体介导的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]酸浆具有较高的食用和药用价值，富含胡萝卜素、类胡萝卜素酯、酸浆苦素A和多糖，具有抗高血糖、抗菌和消炎作用，还有排毒、利尿的功效，被广泛用于溃疡、幽门螺杆菌、肝损伤的治疗。
[0003]体细胞胚胎发生是植物体细胞在重编程发育后被诱导形成或自发转化成胚性细胞的无性生殖过程，是良好的植物遗传转化受体系统和植物生物反应器底物，如人参毛状根。类块根体(Rhizoid tuber，RTB)是一种不同于常规的体细胞胚发生新型结构，可用于植物组织或器官悬浮培养，还可用于种质保存和基因改良。
[0004]现有技术对酸浆的研究多集中于该植物的次生代谢物质的活性检测以及药用有效成分分析等方面。酸浆类块根体(RTB)诱导发生与RTB介导遗传转化仍存在以下技术难题，如培养基种类的筛选、种子萌发、植物生长调节剂种类与浓度筛选、类根体的辨识与判定、最佳外植体的筛选、RTB胚体分化萌发的培养基筛选以及农杆菌侵染时段的选择等。因此，对酸浆体细胞胚介导的高效再生与遗传转化体系方面的研究，尚未见系统报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供类块根体介导的遗传转化方法。
[0006]根据本专利技术具体实施方式的酸浆类块根体介导的遗传转化方法，所述方法包括以下步骤：
[0007](1)培养酸浆无菌苗；
[0008](2)选取酸浆无菌苗的叶盘为外植体，在转化渗透介质中进行农杆菌侵染，随后在共培养培养基中孵育处理，其中，转化渗透介质包括以下组分：1/2MS盐、1/2MS有机、50g/L蔗糖，转化渗透介质的pH为5.8；共培养培养基包括以下组分：MS盐、MS有机、40mg/L乙酰丁香酮、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，共培养培养基的pH为5.8；
[0009](3)将共培养后的外植体转入含有抗生素的类根体诱导培养基中，进行抗性类根体诱导，类根体诱导培养基包括以下成分：1/2MS盐、MS有机、5.0mg/L NAA、3.6g/L结冷胶，类根体诱导培养基的pH为5.8；
[0010](4)将抗性类根体转入含有抗生素的RTB诱导培养基中，进行抗性类根体诱导，其中，RTB诱导培养基包括以下成分：MS盐、MS有机、10.0mg/L TDZ、3.6g/L结冷胶，RTB诱导培养基的pH为5.8；
[0011](5)将离体的抗性类块根置于RTB胚体再生培养基中，诱导胚体的萌发，其中，RTB胚体再生培养基包括以下组分：MS盐、MS有机、2.5mg/L BAP、7.8g/L琼脂粉，RTB胚体再生培养基的pH为5.8；
[0012](6)将萌发的抗性类块根体胚体置于生根培养基中生根，形成实生苗，生根培养基包括以下组分：1/2MS盐、1/2MS有机、0.05mg/L NAA、10g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，生根培养基的pH为5.8；
[0013](7)炼苗、驯化与移栽。
[0014]根据本专利技术具体实施方式的酸浆类块根体介导的遗传转化方法，步骤(2)中，通过转化渗透介质浸泡叶盘侵染法8
‑
10min，期间不断摇动转化液；拭擦叶盘表面的转化介质残液，于黑暗条件下，进行共培育孵育处理。
[0015]根据本专利技术具体实施方式的酸浆类块根体介导的遗传转化方法，步骤(3)中，类根体诱导培养基中加入的抗生素为100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素钠。
[0016]根据本专利技术具体实施方式的酸浆类块根体介导的遗传转化方法，步骤(4)中，类块根诱导培养基中加入的抗生素为100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素钠。
[0017]根据本专利技术具体实施方式的酸浆类块根体介导的遗传转化方法，步骤(7)中，将抗性芽开瓶炼苗7d，用清水流清洗掉根系残留琼脂，将酸浆小苗移栽至培养介质中，于弱光下进行保鲜膜保湿培养，7d后除去保鲜膜，正常培养。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术可快速、高效诱导酸浆RTB结构，并且以酸浆叶片为转化外植体通过RTB介导的方法成功转化外源基因。所诱导出的RTB结构可离体成苗，成苗率100％；所建立的RTB介导的酸浆遗传转化体系，稳定、高效。
[0020]本专利技术提供了酸浆的特殊体细胞胚发生结构RTB的诱导体系，以及RTB介导遗传转化体系的关键技术：
[0021]酸浆RTB类块根体诱导发生的关键技术在于：
[0022]1)类根体诱导与结构检测，其中涉及外植体的筛选、所采用培养基类别、光照或黑暗条件、植物生长调节剂的种类、浓度与组合以及发育时段组织学检测等；
[0023]2)RTB结构的诱导与结构判定，其中涉及类根体再诱导时段、所采用培养基类别、光照或黑暗条件、植物生长调节剂的种类、浓度与组合，发育时段组织学检测等。其中，类根体诱导是RTB结构诱导的前提。
附图说明
[0024]图1显示酸浆类根体、RTB结构的诱导以及RTB结构的组织学起源分析结果；其中，A和A1为酸浆叶片外植体类根体的诱导；A2为酸浆类根体纵向冷冻切片，红色虚框示细胞快速分裂中心；A3为酸浆类根体横向冷冻切片；B为酸浆RTB纵向冷冻切片，粉色虚框示细胞快速分裂中心(b
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1、b
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2、b
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3、b
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4、b
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5和b
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6)；B1为发育早期的酸浆RTB结构；B2为发育中期的酸浆RTB结构；C为酸浆RTB内的多个成熟胚体突破了RTB的边缘结构(粉色箭头与虚框)；C1为处于萌发阶段的酸浆RTB胚体(红色星号)；C2为酸浆RTB再生丛生芽；D
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D3为酸浆再生植株各结构；D为酸浆单花；D1为酸浆未成熟果实；D2为酸浆成熟种子；D3为酸浆再生植株。
具体实施方式
[0025]本专利技术所用培养基见表1：
[0026]表1本专利技术所用培养基名称缩写、名称与组分
[0027][0028][0029]其中，NAA为萘乙酸；BAP为6
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苄氨基嘌呤；TDZ为噻苯隆。
[0030]经过筛选，本专利技术培养基选用的最佳使用浓度如下：
[0031]1、酸浆类根体
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RTB诱导
[0032]1)酸浆类根体诱导发生：黑暗条件下，1/2MS盐+MS有机+5.0mg/L NAA+3.6g/L结冷胶，pH 5.8；
[0033]2)酸浆RTB诱导发生：光照条件下，MS盐+MS有机+10.0mg/L TDZ+3.6g/L结冷胶，pH 5.8；
[0034]3)酸浆RTB胚体萌发：光照条件下，2.5mg/L BAP，其中蔗糖添加量为0；
[0035]2、酸浆RTB介导遗传转化
[0036]1)酸浆类根体诱导发生：黑暗条件下，5.0mg/L NAA，其中蔗糖添加量为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酸浆类块根体介导的遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)培养酸浆无菌苗；(2)选取酸浆无菌苗的叶盘为外植体，在转化渗透介质中进行农杆菌侵染，随后在共培养培养基中孵育处理，其中，转化渗透介质包括以下组分：1/2MS盐、1/2MS有机、50g/L蔗糖，转化渗透介质的pH为5.8；共培养培养基包括以下组分：MS盐、MS有机、40mg/L乙酰丁香酮、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，共培养培养基的pH为5.8；(3)将共培养后的外植体转入含有抗生素的类根体诱导培养基中，进行抗性类根体诱导，类根体诱导培养基包括以下成分：1/2MS盐、MS有机、5.0mg/LNAA、3.6g/L结冷胶，类根体诱导培养基的pH为5.8；(4)将抗性类根体转入含有抗生素的RTB诱导培养基中，进行抗性类根体诱导，其中，RTB诱导培养基包括以下成分：MS盐、MS有机、10.0mg/L TDZ、3.6g/L结冷胶，RTB诱导培养基的pH为5.8；(5)将离体的抗性类块根置于RTB胚体再生培养基中，诱导胚体的萌发，其中，RTB胚体再生培养基包括以下组分：MS盐、MS有机、2.5mg/L BAP、7.8g/L琼脂粉，RTB胚体再生培养基的pH为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐克东，李成伟，张菊，李晓丽，常云霞，于德水，张怡，
申请(专利权)人：周口师范学院，
类型：发明
国别省市：