一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，该方法通过将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，在玉米叶片中诱导表达ZmSWI3D基因，即然后利用Ubi启动子组成型表达ZmSWI3D基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育，提高玉米的抗旱性。提高玉米的抗旱性。提高玉米的抗旱性。

【技术实现步骤摘要】
Trizol，充分混匀，室温放置5
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10min后，加入RNAisoPlus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开），待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5min，12000g4℃离心15min；S12、从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；S13、向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min，12000g4℃离心10min，小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1ml75％的乙醇（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）；S14、室温干燥沉淀2～5min，使酒精完全挥发后，用10
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15μlDEPC
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H2O溶解RNA，用量视沉淀量而定；S2、反转录操作：S21、用DNaseI处理RNA，10μl反应体系包含:DNaseI1μl；DNaseIbuffer1μl；RNA10μg；DEPC
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H2Oupto10μl；轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：0.5μg/μl的oligodTnV1μl；10mM/each的dNTPs1μl；去除DNA的RNA5μg；DEPC
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H2Oupto12μl；轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；S23、在上述体系中加入：5
×
RTbuffer4μl0.1MDTT2μlRNaseInhibitor1μl37℃预热2min，加入M
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MLVRTase1μl，37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl1
×
TE稀释，充分混匀，保存于
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30℃备用；S3、以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米ZmSWI3D基因，ZmSWI3D基因扩增所使用正向克隆引物：5'ATGTTCGAGGCCGTCCG3'、反向克隆引物：5'TCAGCTGGTGGGCCGAGG3'；所述克隆的ZmSWI3D基因CDS序列全长为2349bp，编码782个氨基酸组成的蛋白，编码的蛋白带有SWIRM和SANT保守结构域，以及一个zinc
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binding结构域；S4、玉米染色质重塑蛋白基因ZmSWI3D的过表达载体构建在通用双元载体pCAMBIA3301基础上改造获得的遗传转化载体，具体的，将序列表SEQIDNO：4所示的玉米泛素基因启动子通过SacI和BamHI酶切位点插入pCAMBIA3301中，得到改造遗传转化载体p3301
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Ubi；对得到的改造遗传转化载体p3301
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Ubi用限制性内切酶
SalI和NheI进行酶切，去掉CaMV 35S启动子和GUS基因；将上述克隆所得的玉米ZmSWI3D基因用SalI和NheI消化并回收包含完成ZmSWI3D阅读框的DNA片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301
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Ubi载体，得到ZmSWI3D基因的过表达载体p3301
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Ubi
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ZmSWI3D；S5、利用超声波进行花粉介导的转基因操作，具体步骤如下：1）H99田间管理：将受体玉米自交系H99播于试验田，在抽丝期对雌穗进行严格的套袋隔离，转化的前1 d对雄穗进行严格的套袋隔离；2）花粉处理：选择晴朗的天气收集新鲜的花粉，转化前收集盛花期的花粉以保证活力和花粉量；3）蔗糖溶液配制：当天配制好15 %的蔗糖溶液，将蔗糖溶液置于4 ℃的冰盒中冷却，并保持通入新鲜空气；4）超声波处理：称取2 g的玉米花粉倒入100 ml的烧杯内，加入80 ml的预冷蔗糖溶液，立即搅拌成悬浮液；将悬浮液经超声波细胞破碎仪处理后，加入含ZmSWI3D基因的载体质粒DNA，再次进行超声波处理，使外源基因ZmSWI3D进入花粉粒，超声波处理完毕后，将烧杯置于4 ℃冰盒中，自然沉降180
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300 s，弃上清液，将沉淀花粉粒和5 mL左右剩余溶液转移到培养皿中；5）田间授粉：选取严格套袋隔离的雌穗，将花粉和剩余溶液涂抹于套袋隔离的花丝上，为避免外来花粉混杂，涂抹过程应均匀、迅速完成，涂抹花粉完成后套袋并做好标记，授粉当代收获T0种子；6)空载体玉米获得：将空载体pB7RWG采用步骤1）
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5）所述的方法转入野生型玉米自交系H99中。
[0008]本专利技术具有以下有益效果：通过将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，可以在玉米叶片中诱导表达ZmSWI3D基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育。
附图说明
[0009]图1为本专利技术实施例中 ZmSWI3D结构域。
[0010]图2为本专利技术实施例中p3301
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Ubi图谱。
[0011]图3为本专利技术实施例中ZmSWI3D相对表达量。
[0012]图4为本专利技术实施例中干旱胁迫生存率。
[0013]图5为本专利技术实施例中叶片失水率。
具体实施方式
[0014]为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0015]实施例1玉米染色质重塑蛋白基因ZmSWI3D的克隆本实验室前期研究发现：玉米ZmSWI3D基因的表达在干旱环境下显著上升，因此，
我们利用已公布的ZmSWI3D基因序列（ChromDB数据库，http://www.chromdb.org/）对现有玉米基因组公共数据库（https://www.maizegdb.org/；http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index?db=core）进行同源性搜索比对分析，未发现在这两个公共数据库中注释有ZmSWI3D基因。在ZmSWI3D基因开放阅读框（ORF）核苷酸长度为2382bp（序列表SEQIDNO：1），编码由793个氨基酸组成的SWI3类染色质重塑蛋白。
[0016]根据ZmSWI3D在ChromDB数据库中的CDS序列设计可以扩增全长ORF的一对引物ZmSWI3D
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full
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F（5'ATGTTCGAGGCCGTCCGA3'）和ZmSWI3D
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full
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R（5'TCAGCTGGTGGGCCGAG3'）。为了用于ZmSWI3D基因的过表达载体构建，在上述引物两端分别加入限制性内切酶酶切位点（SalI和NheI）和保护性碱基，以获得载体构建用克隆引物ZmS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，基于花粉介导技术将ZmSWI3D基因的编码区转入到玉米基因组中，然后利用Ubi启动子组成型表达ZmSWI3D基因，从而提高玉米植株的抗旱性。2.如权利要求1所述的一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、总RNA的提取：S11、取3叶1心期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1mlTrizol，充分混匀，室温放置5
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10min后，加入RNAisoPlus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5min，12000g4℃离心15min；S12、从离心机中取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；S13、向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min，12000g4℃离心10min，弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1ml75％的乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5min后，弃去乙醇；S14、室温干燥沉淀2～5min，使酒精完全挥发后，用10
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15μlDEPC
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H2O溶解RNA；S2、反转录操作：S21、用DNaseI处理RNA，10μl反应体系包含:DNaseI1μl；DNaseIbuffer1μl；RNA10μg；DEPC
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H2Oupto10μl；混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：0.5μg/μl的oligodTnV1μl；10mM/each的dNTPs1μl；去除DNA的RNA5μg；DEPC
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H2Oupto12μl；轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；S23、在上述体系中加入：5
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RTbuffer4μl0.1MDTT2μlRNaseInhibitor1μl37℃预热2min，加入M
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MLVRTase1μl，37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl1
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TE稀释，充分混匀，保存于
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30℃备用；S3、以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米ZmSWI3D基因，ZmSWI3D基因扩增所使用正向克隆引物：5'ATGTTCGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春雷，于晓明，樊晓雪，孟新超，金戈，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：