一种用于不稳定化合物的前处理方法技术

本发明专利技术公开了一种用于不稳定化合物的前处理方法，包括以下步骤：1).采样后立刻添加磷酸溶液，按照样品︰所述磷酸溶液的体积比为19︰1的比例添加，所述磷酸溶液为磷酸︰水的体积比为17︰83；2).在前处理过程中少量添加甲酸溶液A来提高质谱信号，所述甲酸溶液A为甲酸︰水的体积比为3:1000，沉淀剂采用甲醇沉淀。本发明专利技术方法解决了在操作过程中由于需要加强酸而造成的操作不便，降低了操作的危险性。磷酸溶液可解决肽类提取回收率低的情况，并且也可使肽类化合物稳定。但是一定浓度的磷酸溶液进质谱通常会影响质谱响应。使用该比例的磷酸溶液可以在解决稳定性和提高提取回收率的同时不影响质谱仪器的信号响应。响质谱仪器的信号响应。响质谱仪器的信号响应。

【技术实现步骤摘要】
一种用于不稳定化合物的前处理方法


[0001]本专利技术涉及一种化合物的前处理方法，具体涉及一种用于不稳定化合物的前处理方法。

技术介绍

[0002]在药物研究中，通常要测定血浆，尿液、胆汁、脑脊液，组织等多种生物基质中的药物浓度，有些样品因为化合物在基质中存在被降解、氧化或者与基质中成分反应等不稳定的因素，导致定量标准曲线不成线性，从而无法准确定量且影响真实结果的测定。
[0003]从LC
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MS生物分析的角度看，前体药物的主要挑战在于如何解决前体药物的不稳定性，而这些不稳定性在生物样品的采集、处理、存储和LC
‑
MS定量分析前的样品制备过程中都可能发生。现阶段解决该问题的常用措施有：1.温度控制，尽可能在较低温度的条件下操作；2.加入酶抑制剂，如肝素钠或EDTA
‑
K2；3.避光操作；4.尽量快速操作。
[0004]这些方法对分析大部分化合物都有很好的效用和效果，但当遇到肽类化合物时，仅通过以上操作手段可能无法解决现有的问题。当肽类存在于溶液中或者生物基质中时，可能发生化学降解和酶降解，很多时候仅通过酸化样品，如使用三氟乙酸即可稳定肽类。但是三氟乙酸的挥发性较强，且进入质谱会对大部分化合物产生信号抑制。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，解决上述现有技术的不足，提供一种用于不稳定化合物的前处理方法，所述方法使用磷酸溶液，所述磷酸溶液为磷酸︰水＝17︰83(V︰V)，按照样品︰所述磷酸溶液为19︰1(V︰V)的比例添加。该方法解决了肽类化合物在溶液或基质中不稳定的问题，还提高了化合物的提取回收率。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种用于不稳定化合物的前处理方法，包括以下步骤：
[0008](1).采样后立刻添加磷酸溶液，按照样品︰所述磷酸溶液为19︰1(V︰V)的比例添加，所述磷酸溶液为磷酸︰水＝17︰83(V︰V)；
[0009](2).在前处理过程中少量添加甲酸溶液A来提高质谱信号，所述甲酸溶液A为甲酸︰水＝3:1000(V︰V)，沉淀剂采用甲醇沉淀。
[0010]通过制备低浓度与高浓度质控样品的t0和不同条件下的稳定性样品进行考察，前处理过程包括在采样后需立刻添加所述磷酸溶液用以稳定化合物并提高提取回收率，在前处理过程中少量添加所述甲酸溶液A来提高质谱信号，沉淀剂采用甲醇沉淀。
[0011]进一步的，步骤(2)中，采样后添加所述磷酸溶液后，具体前处理步骤如下：
[0012]1).分别取1单位体积的样品、校正标样品和质控样品(空白基质，作为双空白和单空白样品)于96孔板或离心管中；
[0013]2).在以上样品中加入1/3单位体积的所述甲酸溶液A，涡旋充分；
[0014]3).在双空白样品中加入1/3单位体积的甲醇溶液B，所述甲醇溶液B为甲醇:水＝
50︰50(V︰V)；
[0015]4).在其他样品中加入1/3单位体积的含10ng/mL维拉帕米的所述甲醇溶液B内标溶液，涡旋充分；
[0016]5).在涡旋后的所有样品中加入6单位体积的100％甲醇溶液；
[0017]6).混匀并充分反应后，离心取上清。
[0018]较佳的，所述步骤6具体为：将96孔板振摇10min，随后在4℃条件下3220g转速离心15min(或1.5mL聚乙烯离心管涡旋1min，随后在4℃条件下12000g转速离心15min)；取上清液60μL置于96孔板中；样品直接进样。
[0019]本专利技术的优点是：
[0020](1)使肽类化合物在溶液或生物基质中稳定；
[0021](2)提高肽类化合物在生物基质中的提取回收率；
[0022](3)相较于强酸的添加，操作更加方便与安全；
[0023](4)能够减少由于酸引入质谱较多而造成的信号抑制现象。
附图说明
[0024]图1是：多肽A在双空白SD大鼠血浆中的色谱图。对于多肽A来说，干扰组分在分析物保留时间的峰面积小于定量下限样品中分析物平均峰面积的20％。
[0025]图2是：多肽A在单空白SD大鼠血浆中的色谱图。verapamil对多肽A的干扰组分在多肽A保留时间的峰面积小于定量下限样品中分析物平均峰面积的20％。
[0026]图3是：多肽A在SD大鼠血浆中最低定量下限的色谱图。峰形对称、LLOQ的峰高＞5倍S/N，扫描点数在8～12个点。
[0027]图4是：多肽A在SD大鼠血浆中的标准曲线。用线性定量，R2＞0.98，R＞0.99，所有校正标样均满足接受标准。
具体实施方式
[0028]实施例所用到的血浆样品均由南京美新诺医药科技有限公司提供。
[0029]本实施例中，采样后立刻添加磷酸溶液，按照样品︰所述磷酸溶液为19︰1(V︰V)的比例添加，所述磷酸溶液为磷酸︰水＝17︰83(V︰V)；
[0030]提取步骤为：
[0031](1)分别取30μL样品、校正标样品和质控样品(取30μL空白基质，作为双空白和单空白样品)于96孔板或1.5mL聚乙烯离心管中；
[0032](2)在以上样品中加入10μL所述甲酸溶液A，涡旋充分；
[0033](3)在双空白样品中加入10μL的甲醇溶液B，所述甲醇溶液B为甲醇:水＝50︰50(V︰V)溶液；
[0034](4)在其他样品中加入10μL含10ng/mL维拉帕米的所述甲醇溶液B内标溶液，涡旋充分；
[0035](5)在涡旋后的所有样品中加入180μL100％甲醇溶液；
[0036](6)将96孔板振摇10min，随后在4℃条件下3220g转速离心15min(或1.5mL聚乙烯离心管涡旋1min，随后在4℃条件下12000g转速离心15min)；
[0037](7)取上清液60μL置于96孔板中；
[0038](8)样品直接进样。
[0039]实施例1：
[0040]1.工作液浓度：150ng/mL(多肽A低浓度LQC)和4000ng/mL(多肽A，高浓度HQC)；
[0041]2.基质：大鼠血浆(含0.85％H3PO4，使用前加入)；
[0042]3.基质中化合物浓度(50倍稀释)：3.00ng/mL(A，LQC)和800ng/mL(A，HQC)；
[0043]4.内标：100ng/mL(Verapamil)；
[0044]5.在聚丙烯tube管中室温放置24h，
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80℃条件下放置14天；
[0045]6.制备t0样品；
[0046]7.提取见以上操作，结果见表1与表2。表1和表2结果显示，多肽A在SD大鼠血浆样品中，在室温条件下放置至少24小时稳定。在超低温冰箱(温度设置为
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80℃)中放置至少14天稳定。多肽A在双空白SD大鼠血浆中的色谱图见图1；多肽A在单空白SD大鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于不稳定化合物的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1).采样后立刻添加磷酸溶液，按照样品︰所述磷酸溶液的体积比为19︰1的比例添加，所述磷酸溶液为磷酸︰水的体积比为17︰83；(2).在前处理过程中少量添加甲酸溶液A来提高质谱信号，所述甲酸溶液A为甲酸︰水的体积比为3:1000，沉淀剂采用甲醇沉淀。2.根据权利要求1所述的用于不稳定化合物的前处理方法，其特征在于，步骤(2)中，采样后添加所述磷酸溶液后，前处理步骤如下：1).分别取1单位体积的样品、校正标样品和质控样品于96孔板或离心管中，所述质控样品为空白基质作为双空白和单空白样品；2).在以上样品中加入1/3单位体积的所述甲酸溶液A，涡旋充分；3).在双空白样品中加入1/3...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵欢，张玲玲，卢金莲，高峥贞，
申请(专利权)人：南京美新诺医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：