本发明专利技术公开了一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段及方法。特征肽段的氨基酸序列如下：GIYQTSNFR。本发明专利技术使用蛋白酶将新冠病毒刺突蛋白酶解为若干小分子肽段后，通过酶解产生的特异性肽段对蛋白含量进行测定。酶解产生的特征肽段为新型冠状病毒刺突蛋白所特有，便于识别与检测。并且以特征肽段标准品为参考，可以直接测量样品中的新冠病毒刺突蛋白的摩尔浓度和含量。本发明专利技术报道的方法只需以特征肽段标准品为参考进行测量，检测过程简单，结果准确。结果准确。结果准确。
【技术实现步骤摘要】
GIYQTSNFR。
[0007]一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的同位素标记肽段，其氨基酸序列如下： GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个
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C，1个
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N。
[0008]本专利技术又提供了一种非医学诊断为目的的用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的方法，包括以下步骤：
[0009](1)按照适当比例混合特征肽段标准品与同位素标记肽段，配置标准溶液，并向待测样品中加入适量的同位素标记肽段，
[0010]其中，特征肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNFR，
[0011]同位素标记肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个
13
C，1个
15
N；
[0012](2)使用蛋白酶进行酶切处理，将新型冠状病毒刺突蛋白酶解成若干肽段；
[0013](3)采用液相色谱
‑
质谱联用系统进行待测样本及标准溶液分析，根据标准溶液的数据建立标准曲线，计算待测样品中酶解后特征肽段的含量，并换算得到待测样品中新冠病毒刺突蛋白的含量。
[0014]本专利技术方法可以用于非医学诊断为目的的检测，比如，实验室内样品的检测等。
[0015]优选的，步骤(2)酶切时，使用变性剂对待测样品中蛋白质进行变形处理，变性剂为占反应体系体积比30％的乙腈或占反应体系质量比0.1％的RapiGest SF。
[0016]优选的，步骤(2)酶切时，使用的蛋白酶为胰蛋白酶。更优选的，酶切处理使用的缓冲体系为50mM Tris
‑
HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。更优选的，步骤(2)酶切时，每隔4～8小时补充一次胰蛋白酶，37℃条件下连续酶切48小时。
[0017]优选的，步骤(3)建立标准曲线时，以特征肽段与同位素标记肽段的峰面积比值为横坐标，特征肽段与同位素标记肽段的质量比为纵坐标，建立标准曲线。
[0018]本专利技术使用蛋白酶将新冠病毒刺突蛋白酶解为若干小分子肽段后，通过酶解产生的特异性肽段对蛋白含量进行测定。酶解产生的特征肽段为新型冠状病毒刺突蛋白所特有，便于识别与检测。并且以特征肽段标准品为参考，可以直接测量样品中的新冠病毒刺突蛋白的摩尔浓度和含量。本专利技术报道的方法无需刺突蛋白标准品，仅以特征肽段标准品为参考进行测量，检测过程简单，结果准确，特征肽段的标准品与蛋白标准品相比，价格低，制备简单，便于保存。
附图说明
[0019]图1为不同蛋白变性剂条件下酶解结果示意图，其中，A：不同变性剂条件下反应8小时后通过特征肽段T6检测的蛋白含量结果；B：不同变性剂条件下反应8小时后通过特征肽段T11检测的蛋白含量结果；图中***表示P<0.001，**表示P<0.01，* 表示P<0.05(下同)。
[0020]图2为不同缓冲条件下蛋白酶解结果示意图，其中，A：不同缓冲体系下反应8 小时后通过特征肽段T6检测的蛋白含量结果；B：不同缓冲体系下反应8小时后通过特征肽段T11检测的蛋白含量结果。体系1：50mM Tris
‑
HCl，pH＝7.6；体系2：50mMTris
‑
HCl，10mM CaCl2，pH＝7.6；体系3：50mM Tris
‑
HCl，pH＝8.0；体系4：50mMTris
‑
HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。
[0021]图3为不同反应时间下蛋白酶解结果示意图。
[0022]图4为不同蛋白酶条件下酶解结果示意图，其中，A：不同蛋白酶条件下反应8 小时后通过特征肽段T6检测的蛋白含量结果；B：不同蛋白酶条件下反应48小时后通过特征肽段T11检测的蛋白含量结果。
[0023]图5为特异性结果质谱图，其中，A：BSA胰蛋白酶水解产物在m/z：543.26>458.22 条件下的检测结果；B：细胞提取液胰蛋白酶水解产物在m/z：543.26>458.22条件下的检测结果；C：新冠病毒刺突蛋白胰蛋白酶水解产物在m/z：543.26>458.22条件下的检测结果。
[0024]图6为特征肽段以及同位素标记肽段的线性回归示意图。
具体实施方式
[0025]实施例1：新冠病毒刺突蛋白酶解产物分析
[0026]1.材料
[0027]新冠病毒刺突蛋白标准物质由中国计量大学研制。L
‑
亮氨酸、L
‑
苯丙氨酸国家标准物质购自中国计量科学研究院。
[0028]胰蛋白酶购自普洛麦格生物技术有限公司。C18固相萃取柱购自沃特世生物有限公司。
[0029]特征肽段由杭州中肽生化有限公司合成。
[0030]2.方法
[0031]2.1胰蛋白酶水解：称取新型冠状病毒刺突蛋白30mg，与8M尿素溶液按1∶3 比例混合后，95℃水浴过夜。然后加入水和Tris
‑
HCl缓冲液(pH＝7.6)，至尿素终浓度1M，Tris
‑
HCl终浓度50mM。最后加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温孵育过夜。反应完成后加入10％甲酸至终浓度为1％终止反应。
[0032]2.2多肽纯化：取若干C18固相萃取小柱，通过重力法进行萃取。先后加入600μL 乙腈，600μL 50％乙腈水溶液，1800μL 2％乙腈、0.1％甲酸水溶液，胰蛋白酶水解液， 1800μL 2％乙腈、0.1％甲酸水溶液。然后将固相萃取小柱转移至新的15mL离心管中，并加入600μL 80％乙腈、0.1％甲酸水溶液进行洗脱。洗脱得到的溶液经离心真空浓缩后复溶在2％乙腈、0.1％甲酸水溶液中，使用0.22μm尼龙膜过滤后即为待上样样品。
[0033]2.3液质联用检测：通过液相色谱
‑
质谱联用仪对待上样样品进行检测，首先通过 data dependent模式对水解产物进行初步分析。然后根据筛选的特征肽段信息人工合成相应的特征肽段纯品，进行参数优化。优化参数完成后，将样品梯度稀释成若干浓度，分析各特征肽段的灵敏度。色谱条件为，色谱柱：Waters CORTECS_T3 2.7μm， 2.1
×
150mm。流动相：A相0.1％甲酸
‑
乙腈；B相：0.1％甲酸
‑
水。程序：0min，14％A∶ 86％B；1min，14％A∶86％B；4min，42％A∶58％B；5min，14％A∶86％B；8min， 14％A∶86％B。流速：0.2mL
·
min
‑1；进样量10μL。
[0034]3.结果
[0035]根据检测结果，并未发现与特征肽段SARS_CoV_2_S_T8相符的检测信号，推测可能是因为该肽段上存在N糖基化或其他修饰。其他特征肽段中，SA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段，其氨基酸序列如下：GIYQTSNFR。2.一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的同位素标记肽段，其氨基酸序列如下：GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个
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C，1个
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N。3.一种非医学诊断为目的的用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照适当比例混合特征肽段标准品与同位素标记肽段，配置标准溶液，并向待测样品中加入适量的同位素标记肽段，其中，特征肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNFR，同位素标记肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个
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C，1个
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N；(2)使用蛋白酶进行酶切处理，将新型冠状病毒刺突蛋白酶解成若干肽段；(3)采用液相色谱
‑
质谱...
【专利技术属性】
技术研发人员：马玉清，夏文强，金荣愉，余笑波，
申请(专利权)人：杭州博度计量科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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