利用预测的洗脱缓冲液盐浓度的阳离子色谱制造技术

本发明专利技术涉及一种产生包括第一靶蛋白质和第二靶蛋白质(P1，P2)的目标洗脱体积(238)的色谱方法。所述方法包括：提供(102)阳离子交换色谱柱(230)；在所述柱上施加(104)蛋白质溶液(202)，所述蛋白质溶液包含所述第一靶蛋白质(P1)、所述第二靶蛋白质以及任选地一种或多种另外的蛋白质(P3、P4、P5、P6)；输入(106)优化标准；计算(108)色谱模拟以用于计算洗脱缓冲液盐浓度(222)，所述洗脱缓冲液盐浓度适于提供与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积；根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界；在所述色谱柱上施加(112)具有所述计算出的盐浓度的洗脱缓冲液(226)；执行(114)洗脱；并且收集(116)计算出的目标洗脱体积。计算出的目标洗脱体积。计算出的目标洗脱体积。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用预测的洗脱缓冲液盐浓度的阳离子色谱


[0001]本专利技术涉及色谱领域，并且特别地涉及用于获得特定蛋白质的阳离子色谱领域。

技术介绍

[0002]阳离子交换色谱是离子交换色谱的一种形式，通常用于基于分子的净表面电荷对分子进行分离。对具有净正表面电荷的分子(例如蛋白质或肽)具有亲和力的带负电荷的离子交换树脂用于制备和分析目的两者。
[0003]蛋白质的净表面电荷随pH而变化，其方式由蛋白质的等电点(“pI”)决定。具有不同pI值的蛋白质在给定的pH下会具有不同程度的电荷，从而对色谱柱中离子交换介质颗粒上带负电荷的表面基团具有不同的亲和力。因此，具有不同pI值的蛋白质会以不同的强度与色谱树脂结合，从而有助于这些蛋白质的分离。
[0004]然而，并非所有需要分离的蛋白质和肽都具有足够不同的pI值以便在色谱柱中实现清晰的分离。此外，分离可能还取决于与柱相互作用的氨基酸侧残基的数量：由于位阻因素，并非蛋白质的所有带电基团都可以参与结合。特别地，在色谱柱中分解蛋白质糖型和包含其他类型翻译后修饰(PTM)的蛋白质是一项挑战。
[0005]糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰(PTM)之一。糖基化涉及寡糖(聚糖)与蛋白质的氨基酸骨架，特别是与丝氨酸/苏氨酸(O
‑
糖基化)或天冬酰胺(N
‑
糖基化)氨基酸残基的共价附接。聚糖残基对蛋白质的生物学功能有重大影响，因为聚糖残基可能影响蛋白质的稳定性、溶解性、抗原性、折叠和血清半衰期。蛋白质糖基化和许多其他形式的PTM(例如磷酸化、甲基化、琥珀酰亚胺化、氧化、N端蛋氨酸损失等)是在涉及各种酶和底物的复杂过程中形成的，并且取决于宿主生物体、生产细胞系和培养条件。
[0006]糖基化和其他类型的PTM是治疗性蛋白质的关键质量属性。通过构象变化的PTM可以调节蛋白质和肽的治疗价值(效力)，例如MAb的补体依赖性细胞毒性(CDCC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
[0007]因此，当涉及选择性洗脱具有特定PTM的蛋白质时，或者当涉及获得包含仅在PTM的类型、数量和/或位置方面彼此不同的两种或更多种蛋白质变体的期望比率的洗脱液时，用于分离经受糖基化和/或其他形式的PTM的蛋白质变体的当前色谱技术存在的问题是严重的问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种用于使用离子交换色谱和如独立权利要求所述的对应的色谱控制系统来获得包含两种或更多种靶蛋白质的目标洗脱体积的方法。在从属权利要求中给出了本专利技术的实施例。如果本专利技术的实施例不是互相排斥的，则可以彼此自由地组合。
[0009]在一个方面，本专利技术涉及一种产生包含第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的目标洗脱体积的色谱方法。该方法包括：
[0010]‑
提供阳离子交换色谱柱；
[0011]‑
在该柱上施加蛋白质溶液，该蛋白质溶液包含至少第一靶蛋白质、第二靶蛋白质以及任选地一种或多种另外的蛋白质；
[0012]‑
将优化标准输入到色谱模拟软件中；优化标准是目标洗脱体积的关于目标洗脱体积中所包含的第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的期望性质；例如，优化标准可以是洗脱体积中所包含的两种或更多种靶蛋白质的定量性质和/或定性性质；定量性质可以是例如洗脱体积中靶蛋白质的绝对量(例如浓度)或者该两种或更多种靶蛋白质的相对量(例如比率)；另外或替代性地，该标准可以是或可以包含一个或多个定性性质，例如该靶蛋白质中的一种或两种靶蛋白质的纯度；优化标准还可以是根据该两种靶蛋白质的一种或多种定性性质和一种或多种定量性质所计算的导数评分值。
[0013]色谱模拟软件被配置为计算适于从色谱柱洗脱第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度，使得能够获得与优化标准最匹配的目标洗脱体积。该计算包括根据多种不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟。
[0014]色谱模拟软件被进一步配置为根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算目标洗脱体积的汇集边界(pooling border)。
[0015]该方法进一步包括：
[0016]‑
在色谱柱上施加具有计算出的盐浓度的洗脱缓冲液；
[0017]‑
使用施加的洗脱缓冲液执行洗脱；并且
[0018]‑
使用计算出的汇集边界收集计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。
[0019]这些特征可以是有利的，因为本专利技术的实施例允许获得包含预定义的量、比率和/或纯度的两种或更多种感兴趣蛋白质的目标洗脱体积，即使这些蛋白质可能具有高度相似的pI值并且在一些洗脱条件下可能具有重叠的洗脱图。
[0020]无意受制于任何理论，本申请人假设达到这种效果是因为洗脱缓冲液的盐浓度不是万能的洗脱盐浓度。相反，该盐浓度是专门针对期望的优化标准(特别是两种或更多种感兴趣靶蛋白质的绝对量或相对量和/或纯度)通过计算预测的浓度。这可以允许避免用于去除洗脱液中的特定靶蛋白质或减少洗脱液中特定靶蛋白质的量的附加处理步骤，并且/或者避免浓缩感兴趣的特定靶蛋白质以便将两种或更多种单独洗脱的靶蛋白质重新组合为期望的比率的附加处理步骤。
[0021]本申请人已经观察到，在一些药物应用场景中，期望提供由以预定义的比例和/或纯度提供的两种或更多种靶蛋白质的混合物组成的药物。例如，药物可以由被称为P1和P2的特定蛋白质P的两种PTM变体的混合物组成，因此如果以特定的量比提供变体P1和P2，则该药物最有效。本专利技术的实施例可以允许执行这样的色谱步骤，该色谱步骤无论如何都可以被执行用于从细胞的全部蛋白质中提取和/或上浓缩感兴趣的特定蛋白质，使得该两种或更多种感兴趣的蛋白质易于在单次色谱运行中被洗脱为期望的比率、量和/或纯度。
[0022]色谱模拟软件可以通过以下方式来实现这种期望的效果：模拟针对不同的(假设的/候选的)洗脱缓冲液盐浓度施加在柱上的蛋白质的多次色谱运行，以识别对于优化标准而言最佳的盐浓度。该通过计算识别的盐浓度然后用于形成或选择待用于实际色谱过程的洗脱缓冲液，使得所形成或选择的洗脱缓冲液的盐浓度与计算出的盐浓度相同。
[0023]通过本专利技术的实施例获得的洗脱缓冲液不是“标准的”/“万能的”洗脱缓冲液，而
是专门适用于优化标准的洗脱缓冲液，可以根据具体情况灵活定义该优化标准。
[0024]根据实施例，该优化标准选自包含以下各项的组：
[0025]a)目标洗脱体积中第一靶蛋白质和第二靶蛋白质的量的期望的比率或比率范围；特别地，该比率可以是5:95至1:1、特别是1:95至1:1的范围中的任何比率；
[0026]b)目标洗脱体积中第一靶蛋白质的期望的量或量范围与第二靶蛋白质的期望的量或量范围的组合；例如：该量可以是绝对量或浓度；
[0027]c)第一靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围与以下各项的组合：
[0028]■
目标洗脱体积中第一蛋白质和第二蛋白质的量的期望的比率
[0029]■
目标洗脱体积中第二靶蛋白质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生包括第一靶蛋白质(P1)和第二靶蛋白质(P2)的目标洗脱体积(238)的色谱方法，所述方法包括：
‑
提供(100)阳离子交换色谱柱(230)；
‑
在所述柱上施加(102)蛋白质溶液(202)，所述蛋白质溶液包含至少所述第一靶蛋白质(P1)和所述第二靶蛋白质(P2)以及任选地一种或多种另外的蛋白质(P3、P4、P5、P6)；
‑
将优化标准输入(106)色谱模拟软件(204)中，所述优化标准是所述目标洗脱体积相对于所述目标洗脱体积中所包含的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的期望性质；
‑
通过所述色谱模拟软件计算(108)适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的洗脱缓冲液盐浓度(222)，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积，所述计算包括根据多个不同的洗脱缓冲液盐浓度来计算多个色谱模拟；
‑
通过所述色谱模拟软件根据至少计算出的盐浓度和输入的优化标准来计算(110)所述目标洗脱体积的汇集边界；
‑
在所述色谱柱上施加(112)具有所述计算出的盐浓度的洗脱缓冲液(226)；
‑
使用施加的洗脱缓冲液执行(114)所述洗脱；并且
‑
使用计算出的汇集边界收集(116)计算出的目标洗脱体积作为单独的级分。2.根据权利要求1所述的色谱方法，所述优化标准选自包括以下各项的组：a)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量的期望的比率或比率范围；b)所述目标洗脱体积中所述第一靶蛋白质的期望的量或量范围与所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围的组合；c)所述第一靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围与以下各项的组合：
·
所述目标洗脱体积中第一蛋白质和第二蛋白质的量的期望的比率；
·
所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的量或量范围；
·
所述目标洗脱体积中所述第二靶蛋白质的期望的纯度或纯度范围；d)上述标准中的两个或更多个标准的组合。3.根据前述权利要求中任一项所述的色谱方法，其中施加的蛋白质溶液(202)包含所述一种或多种另外的蛋白质(P3、P4、P5、P6)。4.根据前述权利要求中任一项所述的色谱方法，
‑
其中根据所述多个不同的洗脱缓冲液盐浓度并根据多个不同的洗脱缓冲液pH值来计算所述多个色谱模拟，所述方法进一步包括：
‑
其中所述计算(108)包括计算洗脱缓冲液盐浓度(222)和洗脱缓冲液pH值的组合，所述洗脱缓冲液盐浓度和所述洗脱缓冲液pH值的组合适于从所述色谱柱洗脱所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质，使得能够获得与所述优化标准最佳匹配的目标洗脱体积，其中执行所述色谱模拟以识别所述洗脱缓冲液盐浓度(222)和洗脱缓冲液pH的组合；
‑
其中根据至少所述洗脱缓冲液盐浓度和所述洗脱缓冲液pH值的计算出的组合以及所述输入的优化标准来计算所述目标洗脱体积的汇集边界；并且
‑
其中施加在所述柱上的所述洗脱缓冲液(226)具有计算出的盐浓度和计算出的pH值。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有小于0.75和/或小于0.5的分辨率因数的蛋白质。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列的蛋白质的糖基化变体。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质是具有相同氨基酸序列并且在FAB片段上包含不同数量的糖基基团的抗体单体。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施加的蛋白质溶液包含各自浓度为至少0.5重量％、特别是至少1重量％、特别是至少2重量％的所述靶蛋白质(P1、P2)中的每种靶蛋白质和如果存在的所述另外的蛋白质(P3
‑
P6)中的每种蛋白质。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施加的蛋白质溶液中所包含的所述第二靶蛋白质(P2)和如果存在的所述另外的蛋白质(P3
‑
P6)中的一种或多种另外的蛋白质对所述柱的固定相具有的亲和力类似于所述第一靶蛋白质对所述固定相的亲和力，引致重叠洗脱行为。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述柱施加的所述蛋白质溶液中的蛋白质的总量等于或小于所述柱的最大蛋白质负载容量，并且特别地在所述最大蛋白质负载容量的50％至100％、例如50％至90％的范围内。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以收集开始时间偏移和收集停止时间偏移的形式指定所述目标洗脱体积的计算出的汇集边界，所述方法包括：
‑
由包括所述色谱柱的自动化色谱系统连续监测自所述洗脱开始以来经过的时间；
‑
当经过的时间等于所述收集开始时间偏移时，由所述色谱系统自动开始收集经洗脱的洗脱缓冲液；并且
‑
当所述经过的时间等于所述收集停止时间偏移时，由所述色谱系统停止收集所述经洗脱的洗脱缓冲液。12.根据前述权利要求中任一项所述的色谱方法，
‑
其中所述多个色谱模拟中的每个色谱模拟是使用两个或更多个洗脱步骤的色谱过程的模拟，由此在每个洗脱步骤中，使用具有不同的洗脱盐浓度的洗脱缓冲液，
‑
其中计算出的洗脱缓冲液盐浓度是一系列不同的、特定于洗脱步骤的洗脱缓冲液盐浓度，并且
‑
其中在所述色谱柱上施加具有计算出的盐浓度的洗脱缓冲液包括：根据计算出的一系列特定于洗脱步骤的盐浓度逐步施加一系列具有所述不同的盐浓度的洗脱缓冲液。13.根据前述权利要求中任一项所述的色谱方法，所述方法包括：
‑
将所述施加的蛋白质溶液中所包含的所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质(P1
‑
P2)中的每一者的量，并且任选地还将所述施加的蛋白质溶液中所包含的如果存在的一种或多种另外的蛋白质(P3
‑
P6)中的每种蛋白质的量输入(104)色谱模拟软件(204)中；
‑
所述模拟根据参数值的集合来计算，所述参数值的集合包括至少：
·
提供的阳离子交换色谱柱的尺寸；以及
·
所述第一靶蛋白质和所述第二靶蛋白质的量，以及任选地还有施加到所述柱上的所述一种或多种另外的蛋白质的量。14.根据权利要求12所述的色谱方法，参数的...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：