寡糖标志物及其在燕窝鉴定中的应用制造技术

本发明专利技术涉及质控标志物，以及应用这类标志物鉴定燕窝的方法。具体而言，本发明专利技术涉及寡糖标志物，以及其在快速、专属、高效、低成本鉴定燕窝原材料及其相关产品中的应用和鉴定方法。燕窝原材料及其相关产品中的应用和鉴定方法。

【技术实现步骤摘要】
寡糖标志物及其在燕窝鉴定中的应用


[0001]本专利技术涉及质控标志物，以及应用这类标志物鉴定燕窝的方法。具体而言，本专利技术涉及寡糖标志物，以及其在快速、专属、高效、低成本鉴定燕窝原材料及其相关产品中的应用和鉴定方法。

技术介绍

[0002]燕窝(edible bird
’
s nest，EBN)是雨燕科金丝燕属(Aerodramus或 Collocalia)的多种鸟类分泌的唾液与其羽绒混合凝结而筑成的巢。其中主要成分为糖蛋白，包含62
‑
63％的蛋白质，25
‑
27％的碳水化合物。现代研究表明，其具有免疫促进作用、抗病毒、促有丝分裂、强心等广泛药理学作用。因此，燕窝，作为一种在亚洲享有盛誉的功能性食品，深受消费者喜爱，具有较高的市场价值。但是，随着需求市场的增长，频频出现燕窝伪劣产品，常常以猪皮、银耳、琼脂等外观及口感类似的物质作为替代品，损害消费者权益，对燕窝市场及相关的质量监管带来巨大冲击。
[0003]目前关于燕窝的鉴定，开发了一系列方法，但所涉及方法均存在特异性差、耗时长、操作繁琐等缺点。例如，通过测定燕窝中的唾液酸含量进行鉴定，也有文献报道通过测定单糖进行鉴定。然而，唾液酸、甘露糖、N
‑
乙酰基
‑
半乳糖胺等单糖特异性均低，在鸡蛋，牛奶等动物制品中广泛存在，其鉴定结果的准确性偏低。再如，通过采用实时荧光PCR(血纤蛋白原和NADH 脱氢酶的靶向基因)和SDS
‑
PAGE二维凝胶电泳等测定氨基酸组成、多肽谱进行鉴定。然而，这些方法灵敏度较低，不适用于蛋白含量较低的燕窝样品。同时，这些方法涉及提取、表征、酶解等多个步骤，操作繁琐耗时，在大批量样品的检测中，产生较高成本。在红外光谱、LC
‑
MS结合统计学等其他手段中均存在类似的局限性。
[0004]因此，迫切需要发展对燕窝中独有的标志性成分的筛选和鉴定，建立具有简单快速、准确、低成本、高灵敏度、高特异性、高重复性，并且适用于大批量样本的商业应用的鉴定方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及用于燕窝鉴别的寡糖标志物、寡糖标志物的制备方法、通过寡糖标志物鉴定燕窝的方法，以及寡糖标志物在快速、专属、高效、低成本鉴定燕窝原材料及其相关产品中的应用。
[0006]本专利技术所述的寡糖标志物及其在燕窝快速鉴定中的应用具有如下特点：特异性强、灵敏度高、操作简单、30min内可完成检测、实用性强，在燕窝原材料与相应产品均适用，具有广阔的市场前景和较大的经济和社会效益。
[0007]在本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种鉴别燕窝的方法，包括：
[0008]a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
[0009]b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物。
[0010]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述检测方法选自色谱分析法、
光谱分析法、质谱分析法、色谱联用分析法、色谱
‑
光谱联用分析法、色谱
‑
质谱联用分析法、毛细管电泳分析法、免疫分析法、核酸适配子结合分析法及其组合；优选地，所述检测方法为液相色谱
‑
质谱联用法，特别优选LC
‑
DAD
‑
Q
‑
TOF
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MS法和液相色谱
‑
三重四极杆串联质谱(LC
‑
QqQ
‑ꢀ
MS/MS)。
[0011]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的色谱柱选自硅胶基质色谱柱、聚合物基质色谱柱、或者其他无机填料色谱柱，优选地，使用C18十八烷基键合硅胶液相色谱柱、 C8辛烷键合硅胶液相色谱柱、NH2氨基键合硅胶色谱柱、二醇基键合硅胶色谱柱、苯基键合硅胶色谱柱、离子交换色谱柱或者酰胺基键合硅胶色谱柱。
[0012]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈、异辛烷、正己烷、正葵烷、环己烷、二硫化碳、四氯化碳、苯、二甲苯、甲苯、氯苯、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、氯仿、苯胺、吡啶、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或其组合，优选地，所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈或其组合。
[0013]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述质谱为Q
‑
TOF质谱。
[0014]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，还包括在进行样品鉴定前将燕窝样品制备为样品溶液的步骤，优选地，采用水性溶剂制备样品溶液，更优选地，所述水性溶剂为甲醇或水，尤其优选地，所述水性溶剂是甲醇：水体积比为0％～70％的水性溶剂。
[0015]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，还包括将燕窝样品进行柱前衍生化的步骤，优选地，采用具有生色团的衍生化试剂如2
‑
AA、2
‑ꢀ
AB、PMP、2
‑
AP、ABP、ABME、HOA、AMAC、3
‑
(乙酰氨基)
‑6‑
氨基
‑ꢀ
吖啶(AA
‑
Ac)，ANTS、苯肼、丹磺酰肼等进行衍生化，更优选地，采用ABEE (氨基苯甲酸乙酯,4
‑
aminobenzoic acid ethyl ester,Benzocaine)进行衍生化的步骤。
[0016]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，其包括以下步骤：
[0017](1)制备样品溶液；
[0018](2)将步骤(1)中的样品溶液用ABEE进行衍生化；
[0019](3)使用液相色谱
‑
质谱联用法对衍生化样品进行分离与检测，得到样品的保留时间与质荷比；
[0020](4)将样品的保留时间与质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。
[0021]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱
‑
质谱联用法的图谱中，所述寡糖标志物为：保留时间为4.26min，质荷比为619.2403 的寡糖标志物；保留时间为5.38min，质荷比为822.3202的寡糖标志物；或者保留时间为6.49min，质荷比为660.2664的寡糖标志物。
[0022]在本专利技术的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述燕窝样品为燕窝原材料或燕窝产品，其中，优选地，所述燕窝原材料包括燕盏、燕角、燕丝、燕饼、燕碎或燕条，更优选地，所述燕窝原材料包括白燕盏、黄燕盏、血燕盏或毛燕盏；所述燕窝产品包括即食燕窝、浓稠型燕窝或燕窝饮品。
[0023]在本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种鉴别燕窝的方法，包括：
[0024]a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
[0025]b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别燕窝的方法，包括：a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物。2.权利要求1所述的鉴别燕窝的方法，其中，所述检测方法选自色谱分析法、光谱分析法、质谱分析法、色谱联用分析法、色谱
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光谱联用分析法、色谱
‑
质谱联用分析法、毛细管电泳分析法、免疫分析法、核酸适配子结合分析法及其组合；优选地，所述免疫分析法包括：特异性抗体分析法、ELISA分析法或胶体金法；优选地，所述光谱分析法包括：核磁共振光谱分析法(NMR)、紫外分光光度法、近红外分光光度法、X射线粉末衍射法、拉曼光谱分析法、傅里叶变换红外光谱法；优选地，所述色谱分析以及联用分析法包括：薄层色谱分析法、气相色谱分析法(GC)，高效液相色谱分析法(HPLC)、液相色谱分析法、亲水相互作用色谱分析法、凝胶渗透色谱分析法、离子色谱分析法、色谱
‑
质谱联用分析法例如液相色谱
‑
质谱联用法(LC
‑
MS)、气相色谱
‑
质谱联用法(GC
‑
MS)、气相色谱
‑
红外光谱联用法、气相色谱
‑
液相色谱联用法、液相色谱
‑
核磁共振联用法；更优选地，所述检测方法为液相色谱
‑
质谱联用法，特别优选LC
‑
DAD
‑
Q
‑
TOF
‑
MS法、液相色谱
‑
三重四极杆串联质谱(LC
‑
QqQ
‑
MS/MS)。3.权利要求1～2中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的色谱柱选自硅胶基质色谱柱、聚合物基质色谱柱、或者其他无机填料色谱柱；优选地，使用C18十八烷基键合硅胶液相色谱柱、C8辛烷键合硅胶液相色谱柱、NH2氨基键合硅胶色谱柱、二醇基键合硅胶色谱柱、苯基键合硅胶色谱柱、离子交换色谱柱或者酰胺基键合硅胶色谱柱；更优选地，使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱或者Waters UPLC XBridge BEH Amide色谱柱。4.权利要求1～3中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈、异辛烷、正己烷、正葵烷、环己烷、二硫化碳、四氯化碳、苯、二甲苯、甲苯、氯苯、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、氯仿、苯胺、吡啶、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或其组合；优选地，所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈或其组合；更优选地，所述液相色谱的流动相为：0.1％～0.5％甲酸水溶液和0.1％～0.5％甲酸乙腈溶液。5.权利要求1～4中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中还包括在进行样品鉴定前将燕窝样品制备为样品溶液的步骤；优选地，采用水性溶剂制备样品溶液，更优选地，所述水性溶剂为甲醇或水，尤其优选地，所述水性溶剂是甲醇：水体积比为0％～70％的水性溶剂。6.权利要求1～5中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中还包括将燕窝样品进行柱前衍生化的步骤；优选地，包括采用2
‑
AA、2
‑
AB、PMP、2
‑
AP、ABP、ABME、HOA、AMAC、3
‑
(乙酰氨基)
‑6‑
氨基
‑
吖啶(AA
‑
Ac)，ANTS、苯肼或丹磺酰肼进行衍生化的步骤；
优选地，包括采用ABEE进行衍生化的步骤。7.权利要求1～6中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其包括以下步骤：(1)制备样品溶液；(2)将步骤(1)中的样品溶液用ABEE进行衍生化；(3)使用液相色谱
‑
质谱联用法对衍生化样品进行分离与检测，得到样品的保留时间与质荷比；(4)将样品的保留时间与质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。8.权利要求1～7中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中，所述液相色谱
‑
质谱联用法的图谱中，所述ABEE衍生化的寡糖标志物为下列的一种或多种：保留时间为4.26min，质荷比为619.2403的ABEE衍生化的寡糖标志物；保留时间为5.38min，质荷比为822.3202的ABEE衍生化的寡糖标志物；或者保留时间为6.49min，质荷比为660.2664的ABEE衍生化的寡糖标志物。9.权利要求1～8中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中，所述ABEE衍生化的寡糖标志物为保留时间为4.26min，质荷比为619.2403的ABEE衍生化的寡糖标志物。10.权利要求1～9中任一项所述的鉴别燕窝的方法，包括：a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物；其中，燕窝样品采用ABEE进行柱前衍生化；所述检测方法为液相色谱
‑
质谱联用法，所述色谱条件为：使用C18十八烷基键合硅胶液相色谱柱；所述液相色谱的流动相为：0.1％～0.5％甲酸水溶液和0.1％～0.5％甲酸乙腈溶液；质谱为Q
‑
TOF质谱；所述ABEE衍生化的寡糖标志物为下列的一种或多种：保留时间为4.26min，质荷比为619.2403的ABEE衍生化的寡糖标志物；保留时间为5.38min，质荷比为822.3202的ABEE衍生化的寡糖标志物；或者保留时间为6.49min，质荷比为660.2664的ABEE衍生化的寡糖标志物；优选为保留时间为4.26min，质荷比为619.2403的ABEE衍生化的寡糖标志物。11.权利要求1～5中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其包括以下步骤：(1)制备样品溶液，其中所述样品溶液不经衍生化直接用于后续步骤；(2)使用液相色谱
‑
质谱联用法对样品进行分离与检测，得到样品的保留时间；(3)将样品的保留时间和/或质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。12.权利要求1～5和11中任一项所述的鉴别燕窝的方法，其中，所述寡糖标志物为保留时间为2.143min的寡糖标志物。13.权利要求1～5和11～12中任一项所述的鉴别燕窝的方法，包括：a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物；其中，燕窝样品不进行衍生化；所述检测方法为液相色谱
‑
质谱联用法，所述色谱条件为：使用酰胺基键合硅胶色谱柱；所述液相色谱的流动相为：0.1％～0.5％甲酸水溶液和0.1％～0.5％甲酸乙腈溶液；
质谱为QqQ
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MS/MS质谱；所述寡糖标志物为保留时间为2.143min的寡糖标志物。14.权利要求1～13中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩全斌，李利锋，程荟元，郎俊，
申请(专利权)人：香港名贵中药检定中心有限公司，
类型：发明
国别省市：