一种生物-化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法技术

本发明专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种生物

【技术实现步骤摘要】
一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法


[0001]本专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法。

技术介绍

[0002]目前关于微量或痕量有机污染物污染的水体如地表水、污水处理厂出水或再生水中雌激素内分泌干扰化合物的研究大都集中于采用化学分析手段对特定内分泌干扰化合物进行定性和定量分析。再生水中内分泌干扰物的浓度低，常规的分析方法准确性不高，并且分析仪器价格昂贵，成本非常高，难以进行推广和普及。再生水样品与一般样品不同，具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度低于现有方法的检出限或者样品复杂，机体干扰严重的情况下，直接测定是不可能的。生物法是判定化合物是否为内分泌干扰物及其内分泌干扰活性大小的非常有前景的方法，在内分泌干扰物定量分析方面质谱法的灵敏度和准确度都很高。斑马鱼由于具有繁殖周期短、产卵量高，且卵是透明的一系列特点而广泛应用于环境毒理学领域中。斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87％，且斑马鱼具有与人类相似的生理学特征，例如斑马鱼内分泌系统与人类的相似。因此，近十几年来，斑马鱼广泛应用于测试或筛选内分泌干扰物。
[0003]多种环境内分泌干扰化合物的相互作用研究较少。单一环境内分泌干扰化合物往往对生物的影响很弱，但与其他环境内分泌干扰化合物联合作用后出现效应的协同，这种协同作用具有非常重要的意义。环境内分泌干扰化合物在环境中常常是以混合状态存在，而对单一环境内分泌干扰化合物的活性测定难以体现环境中内分泌干扰物的实际活性。
[0004]现有公告号为CN102660644B的专利文件公开了一种调控斑马鱼卵黄蛋白原 mRNA水平的方法，其是对待检测水生生物肝脏的总RNA进行提取，并对其中的卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA表达水平进行检测，可应用于水生生物类雌激素干扰物的检验领域。
[0005]文献《斑马鱼(Danio rerio)、河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)卵黄蛋白原mRNA特性研究及其在环境监测中的应用》中，应用半定量R T一P C R法检测环境雌激素对雄性鱼体卵黄蛋白原mRNA表达的诱导，实验鱼VTG表达基因可作为分子模型应用于环境雌激素检测中。
[0006]目前的现有技术基本都是用一种雌激素化合物如PFOS或E2刺激斑马鱼或其他鱼体，并没有考虑环境中污染物不是独立存在的，而是和其他化合物联合存在的，各种化合物联合存在时具有增强或拮抗的毒性作用，即水环境中确实存在E2，但是由于其他化合物的拮抗作用，并没有引起VTG的诱导，所以并不能根据VTG 没有诱导就推断没有雌激素化合物，实际应用起来存在局限性。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决上述问题，提供了一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内
分泌干扰化合物污染的方法。
[0008]具体是通过以下技术方案来实现的：
[0009]一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，包括以下步骤：
[0010]1、化学分析：采用GC
‑
MS法对再生水环境雌激素内分泌干扰化合物进行污染检测，在检测前对水样进行前处理；
[0011]进一步，所述的前处理，分为邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理以及固醇和酚类化合物分析水样前处理。
[0012]进一步，所述的邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理，具体方法为：在水样中加入氯化钠，水样：氯化钠＝50ml：1g，摇匀后加入乙酸乙酯，水样：乙酸乙酯＝25ml：1ml，重复萃取3
‑
4次，合并萃取液，氮吹定容后浓缩500倍。
[0013]进一步，所述的固醇和酚类化合物分析水样前处理，具体方法为：在水样中加入双酚A
‑
d16，加入量为200ng.L
‑
1，混匀。
[0014]进一步，所述的GC
‑
MS法，具体分析方法为：上样前依次用甲醇和超纯水活化HLB小柱，将水样以5mL/min的流速上样，用10
‑
20mL甲醇洗脱小柱，氮吹定容至1mL体积，加入七氟丁酸酐30μL，于30℃下衍生30min，氮吹至干，加入1mL正己烷，浓缩500倍后进行色谱分析，色谱柱采用Rtx
‑
5ms(30
×
0.25
ꢀ×
0.25)。
[0015]进一步，所述的色谱分析，条件为：升温程序：起始温度50℃，保持1min；以10℃/min的速度上升到200℃，保持1min；以10℃/min速度上升到280℃，保持2min；以30℃/min速度上升到310℃，保持5min。
[0016]2、生物分析：采用实时定量PCR方法检测性成熟斑马鱼雄鱼卵黄蛋白原 (VTG1)的表达，并以β
‑
actin为内参基因建立VTG1转录水平的检测体系，再通过暴露实验分析再生水雌激素内分泌干扰化合物的污染程度。
[0017]进一步，所述的生物分析法，具体包括以下步骤：
[0018](1)样品采集与预处理
[0019]采集的再生水样品过夜澄清，获得澄清再生水，弃掉底部固体沉积物；
[0020](2)暴露实验
[0021]选择3
‑
4个月大的健康雄性斑马鱼为暴露对象，充分曝气除氯自来水水样为阴性对照用水。设置三个平行样，每个平行样包含5条随机获取的雄鱼。采集样品与对照同时暴露，暴露时间为14天，暴露期间每天喂食丰年虾2次，每天换水。成熟雄鱼暴露后，处死鱼，解剖，获取肝脏组织，迅速收入
‑
80℃冰箱中保存；
[0022](3)鱼样品处理
[0023]采用RNA提取试剂盒提取RNA，采用反转录试剂盒将RNA反转录得到 cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR检测成年雄性斑马鱼卵黄蛋白原Vtg1表达水平，进而指示环境雌激素内分泌干扰化合物的污染；荧光定量PCR反应体系为qPCR Master Mix 10μL、cDNA模板1μL、 Nuclease
‑
free Water 7μL和上下游引物各1μL；反应在CFX96TM Real
‑
Time System实时定量PCR仪中进行；
[0024]Vtg1引物序列为：F:5
’‑
CCTTGGAGAAAATTGAGGCTATC
‑3’
；R:5
’‑
CTGAATGAACTCGGGAGTGGTA
‑3’
；
[0025]β
‑
actin引物序列为：F:5
’‑
TCTGGCATCACACCTTCTACAAT
‑3’
；R:5
’ꢀ‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)化学分析：采用GC
‑
MS法对再生水环境雌激素内分泌干扰化合物进行污染检测，在检测前对水样进行前处理；(2)生物分析：采用实时定量PCR方法检测性成熟斑马鱼雄鱼卵黄蛋白原(VTG1)的表达，并以β
‑
actin为内参基因建立VTG1转录水平的检测体系，再通过暴露实验分析再生水雌激素内分泌干扰化合物的污染程度。2.如权利要求1所述的一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，其特征在于，所述的前处理，分为邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理以及固醇和酚类化合物分析水样前处理。3.如权利要求2所述的一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，其特征在于，所述的邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理，具体方法为：在水样中加入氯化钠，水样：氯化钠＝50ml：1g，摇匀后加入乙酸乙酯，水样：乙酸乙酯＝25ml：1ml，重复萃取3
‑
4次，合并萃取液，氮吹定容后浓缩500倍。4.如权利要求2所述的一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，其特征在于，所述的固醇和酚类化合物分析水样前处理，具体方法为：在水样中加入双酚A
‑
d16，加入量为200ng.L
‑1，混匀。5.如权利要求1所述的一种生物
‑
化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，其特征在于，所述的GC
‑
MS法，具体分析方法为：上样前依次用甲醇和超纯水活化HLB小柱，将水样以5mL/min的流速上样，用10
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20mL甲醇洗脱小柱，氮吹定容至1mL体积，加入七氟丁酸酐30μL，于30℃下衍生30min，氮吹至干，加入1mL正己烷，浓缩500倍后进行色谱分析，色谱柱采用Rtx
‑
5ms(30
×
0.25
×
0.25)。6.如权利要求5所述的一种生物
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化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，其特征在于，所述的色谱分析，条件为：升温程序：起始温度50...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶婷，杨瑞泉，何舒茂，张翔，胡荣方，李灿，
申请(专利权)人：贵阳学院，
类型：发明
国别省市：