特异性结合CD133的核酸适配体、其筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种特异性结合CD133的核酸适配体、其筛选方法及应用。所述核酸适配体是通过工程化细胞SELEX筛选法进行多轮筛选获得多条CD133的核酸适配体候选序列。所述核酸适配体具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.6中任意一者所示的核苷酸序列。二级结构预测显示本发明专利技术的核酸适配体均具有稳定的茎环状或发卡状结构，核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。本次筛选的核酸适配体能和CD133特异、稳定的结合，在CD133相关的肿瘤诊断和治疗等方面具有广阔的应用前景。断和治疗等方面具有广阔的应用前景。断和治疗等方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
特异性结合CD133的核酸适配体、其筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种核酸适配体，具体涉及一种特异性结合CD133的核酸适配体、其筛选方法及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]CD133，也称为Prominin
‑
1，是一种最初在造血干细胞和祖细胞中发现的五次跨膜、高度糖基化的糖蛋白，与质膜中的胆固醇相关。近年来，它已被鉴定为多种癌症干细胞(CSC)肿瘤表面标记物，包括脑癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌和结直肠癌等。CD133表达与其他潜在的CSC标记物结合时，常与多种肿瘤患者的临床结果相关。开发一种有效的CD133亲和分子，如核酸适配体，可以作为识别肿瘤细胞表面CD133蛋白的探针，这将极大地帮助解决疾病诊断和靶向治疗问题。尤其是对于具有放疗和化疗耐药性、分化潜能和高致瘤性的肿瘤的诊断和治疗具有深远意义。
[0003]核酸适配体也称为适配体、适配子等，是从人工合成的核酸文库中在体外筛选得到的短的单链DNA或RNA，能够以高亲和力和选择性结合特定靶点，如离子、小分子、蛋白质和细胞。适配体主要通过空间结构、离子相互作用、氢键、范德华力和疏水性的匹配，形成多种二级结构(如发夹、茎环、凸起等)，进一步形成独特的三维结构特异性地识别靶标分子，以实现功能类似于抗体。然而，适配体具有独特的化学和生物学特性，这与传统抗体不同，如易于化学合成、高化学稳定性、小分子量、低免疫原性、低成本和易于修饰等。因此，适配体在癌症诊断、生物标记物发现、药物递送治疗和治疗等领域显示出巨大潜力。
[0004]SELEX是通过指数富集的配体系统进化技术过程，从随机寡核苷酸文库中获得特定的适配体。使用传统SELEX开发的许多适配体缺乏治疗应用所需的结合亲和力和特异性。大多数适配体是通过使用纯化的蛋白质筛选的，它们可能无法识别细胞表面蛋白质的天然构象，因为纯化形式的细胞表面蛋白质的分子结构和形态可能与细胞膜天然分子结构和形态不同。此外，在分离和纯化低丰度膜蛋白方面也存在技术挑战。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种特异性结合CD133的核酸适配体、其筛选方法及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0007]本专利技术实施例提供了一种特异性结合CD133的核酸适配体，它具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6中任意一者所示的核苷酸序列。
[0008]本专利技术实施例还提供了所述特异性结合CD133的核酸适配体于制备能够特异性识别和结合靶蛋白CD133的产品中的应用。
[0009]本专利技术实施例还提供了一种试剂盒，其包括前述的特异性结合CD133的核酸适配体。
[0010]本专利技术实施例还提供了前述的特异性结合CD133的核酸适配体或试剂盒于制备肿瘤检测试剂或肿瘤治疗药物中的应用。
[0011]本专利技术实施例还提供了一种核酸适配体的筛选方法，其包括：
[0012]1)利用慢病毒体系对CHO
‑
K1细胞进行细胞转染，获得CD133稳定表达的CD133细胞系，用于靶细胞的正筛选；
[0013]2)选取未进行转染的CHO
‑
K1细胞系作对照细胞，用于靶细胞的负筛选；
[0014]3)利用cell
‑
SELEX技术进行CD133核酸适配体的筛选，获得所述特异性结合CD133的核酸适配体。
[0015]与现有技术相比，本专利技术以上所提供的技术方案的优点至少包括：
[0016]1)本专利技术通过cell
‑
SELEX技术筛选得到的核酸适配体，与传统以纯化蛋白或人工合成蛋白为靶点相比，具有亲和力高、特异性强，能更好的与天然状态下的表达CD133的细胞进行结合；
[0017]2)本专利技术筛选出的一种CD133核酸适配体能够高效特异的结合靶蛋白CD133，具有明显的亲和力，这对于癌症的早期诊断、分型分析和治疗等方面应用提供了一种有效的工具和手段。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅作为本文专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
[0019]图1是本专利技术一典型实施方式中工程化高表达CD133稳转细胞系的验证图；
[0020]图2是本专利技术一典型实施方式中利用cell
‑
SELEX方法筛选CD133的核酸适配体的示意图；
[0021]图3是本专利技术一典型实施方式中利用Mfold软件模拟的适配体C1、Cs1、C5、Cs5、C53和Cs53的二级结构示意图；
[0022]图4a
‑
图4f是本专利技术实施例1中各核酸适配体与CD133细胞或CHO
‑
K1细胞结合的流式分析图；
[0023]图5是本专利技术实施例2中核酸适配体Cs1与CD133细胞的解离常数曲线拟合图；
[0024]图6是本专利技术实施例2中核酸适配体Cs5与CD133细胞的解离常数曲线拟合图；
[0025]图7是本专利技术实施例2中核酸适配体Cs53与CD133细胞的解离常数曲线拟合图；
[0026]图8是本专利技术实施例2中核酸适配体Cs5与CD133细胞的荧光共聚焦显微图；
[0027]图9是本专利技术实施例3中核酸适配体Cs5与肠癌细胞HCT116的荧光共聚焦显微图。
具体实施方式
[0028]如前所述，鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出了本专利技术的技术方案，采用改良的cell
‑
SELEX方法获得CD133候选适配体。本专利技术构建了过表达CD133的CHO
‑
K1细胞作为靶细胞，CHO
‑
K1细胞作为cell
‑
SELEX的对照细胞。这种基于工程化细胞系的cell
‑
SELEX方法有其独特的优点，比如分离的适配体可以特异性地结
合具有天然构象的细胞表面蛋白质，可以更准确地反映其生物信息；而且适配体可以直接和膜蛋白相互作用以识别整个细胞。
[0029]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0030]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合CD133的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6中任意一者所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的特异性结合CD133的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6中任意一者所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的特异性结合CD133的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的特异性结合CD133的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体具有稳定的茎环状或发卡状结构。5.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的特异性结合CD133的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体能够特异性识别并稳定结合靶蛋白CD133。6.权利要求1
‑
5中任一项所述的特异性结合CD133...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴仁军，李文静，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：