EPH2A适配体及其用途制造技术

本发明专利技术属于基因疗法的领域。特别地，本发明专利技术涉及基于EphA2特异性RNA的构建体，所述构建体可用于治疗、预防和诊断EphA2表达癌症。预防和诊断EphA2表达癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】EPH2A适配体及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年6月3日提交的欧洲专利申请EP19382451.3的权益。


[0003]本专利技术属于基因构建体和疗法的领域。特别地，其涉及特异性结合EphA2的RNA适配体及其用途。

技术介绍

[0004]肝配蛋白(Eph)受体是参与若干种过程(包括血管生成、组织边界形成、细胞迁移和细胞塑性)的受体酪氨酸激酶的最广泛亚家族。这些受体是细胞
‑
细胞相互作用和运动中充分确立的介体，并且在人类癌症中表达，所述人类癌症诸如黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和食道癌。在这些受体中，EphA2(肝配蛋白A型受体2)已经与许多对恶性进展至关重要的过程有牵连，所述过程诸如迁移、侵袭、转移、增殖、存活和血管生成。为此，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的多种临床前模型中，对EphA2的抑制导致减少的肿瘤生长、存活期和肿瘤诱导的血管生成(Tandon等人；Kasinski和Slack；Quinn等人)。常常向患有高级别疾病的患者施用较高的治疗剂量；这些患者常常由于对正常组织的非特异性靶向而遭受毒性。这突出了对具有改善安全性和功效概况的新方式的需要。
[0005]肉瘤是罕见的高级别肿瘤，其具有高的发病率和死亡率。在过去的二十年中，其总体发生率一直在以26％的估计速率增加。三分之一的肉瘤落在低突变负担的类别内，并且其特征在于称为染色体易位的特定复发性遗传变化。该类别的肉瘤被称为易位相关肉瘤(在下文中为TAS)，其尤其包括尤文肉瘤(在下文中为ES)、腺泡状横纹肌肉瘤(在下文中为ARMS)、滑膜肉瘤(在下文中为SS)。这些染色体易位(及其相关融合产物)的两个非常重要的特性是其一致性和特异性。多项研究已经表明，在给定肉瘤的大多数情况下发生相同的易位(或在一些情况下，相关的易位组之一)，因此易位或易位组在肉瘤类别内是一致的(Xiao等人，在该参考文献中公开了这些易位的染色体中的确切位置和所得融合物，并且将其通过引用并入本文)。此外，该易位或相关易位组之一不会发生在任何其他类型的肉瘤中，因此易位对于肉瘤类别具有特异性。因此，在易位或其融合产物与肉瘤类别之间存在非常密切的关系。
[0006]最近，已经显示EphA2在ES细胞中表达，并且为以非激酶依赖性方式对ES的侵袭性特性所必需的。因此，阻断EphA2表达或其功能对于治疗ES可以具有治疗性用途(Garcia
‑
Moncl
ú
s等人)。
[0007]RNA技术的最新进展为开发针对肉瘤和其他癌症的疗法提供了新的和有希望的工具。这些技术之一是适配体技术。作为治疗性试剂，RNA适配体与小分子抑制剂或基于蛋白质的试剂相比具有若干个优点。与大多数小分子抑制剂不同，适配体是高度特异性的并且可用于靶向疗法。与抗体相反，适配体可以容易地化学合成，并且适于化学修饰，所述化学修饰使其对核酶有抗性并且改善其体内药代动力学。此外，化学修饰的RNA适配体几乎没有
免疫原性，因此对临床应用安全得多。
[0008]然而，即使已知适配体是至少具有上面所指出的优点的强大治疗性工具，但最新技术进展中仍然存在悬而未决的使用RNA适配体的有效癌症治疗。

技术实现思路

[0009]感兴趣地，本专利技术的作者已开发了可用于治疗、预防和诊断癌症、特别是EphA2表达癌症的RNA适配体和基于它们的构建体。
[0010]到目前为止，所有的尝试都集中于将作为EphA2靶向载体的适配体用于EphA2表达细胞。
[0011]令人惊讶的是，本专利技术人已发现包含序列SEQ ID NO:1的适配体能够通过其自身对EphA2表达癌细胞施加显著的治疗作用。实施例4，图3C显示了包含序列SEQ ID NO:1的适配体的施用降低肿瘤细胞的克隆能力。
[0012]将SEQ ID NO:1掺入除了所述适配体之外还包含siRNA的复合物内证实了癌细胞的克隆活性的该降低。从图10中可以得出结论，当所述复合物包括序列SEQ ID NO:1时，EphA2表达癌细胞的克隆活性显著降低。
[0013]下面的实施例6显示了包含序列SEQ ID NO:1的适配体的施用延迟肿瘤的发生。
[0014]这是首次基于与EphA2表达癌细胞的结合报道了具有这种治疗行为的RNA适配体。
[0015]因此，在第一方面，本专利技术涉及特异性结合EphA2的RNA适配体，所述RNA适配体：
[0016](i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者可替代地，
[0017](ii)由序列SEQ ID NO:1组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶部分是取代的嘧啶；或者可替代地，
[0018](iii)包含序列SEQ ID NO:1，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的所述嘧啶部分是取代的嘧啶；
[0019]其中所述术语“取代的嘧啶”在所述核苷酸是胞嘧啶时是具有式(I)的嘧啶，或在所述核苷酸是尿嘧啶时是具有式(II)的嘧啶，
[0020][0021]其中与形成式(I)或(II)的嘧啶环的碳或氮原子中的至少一个结合的至少一个氢基团被非氢基团取代，所述非氢基团赋予所述适配体针对降解的稳定性。已经在现有技术中报道为通过取代嘧啶环改善适配体稳定性(体外或体内)的基团中的任一种可以用作“非氢基团”。
[0022]本专利技术人进行结构分析并且得出结论：获得环二级结构的SEQ ID NO:1与EphA2蛋白结合。为了内化细胞，与EphA2的结合是必需的。但是本专利技术的适配体不仅能够作为其他靶向元件被内化，而且它一旦在EphA2表达细胞内就能够通过其自身提供抗癌作用。
[0023]序列SEQ ID NO:1所赋予的技术作用在与EphA2的结合和内化方面是稳健的，使得当形成较长适配体(SEQ ID NO:4)的一部分进行测试时和当形成较大构建体(如可以为序
列SEQ ID NO:17的复合物)的一部分进行测试时，发现相同的行为。在两种情况下，所述序列保持与EphA2表达癌细胞有效结合，并内化细胞的能力。
[0024]本专利技术还提供了RNA适配体，其特异性结合EphA2并且：
[0025](i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者
[0026](ii)包含序列SEQ ID NO:2，任选地包含位于序列SEQ ID NO:2的位置1
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20和46
‑
51中任一者内的一个、两个或三个取代。
[0027]除上述之外，图10还显示了本专利技术的适配体不仅将siRNA携带至靶细胞，而且适配体和siRNA两者一旦被内化就可以对癌细胞施加有益的治疗作用。图3B已经显示了当适配体被内化时，癌细胞的克隆能力大幅度降低，所述能力在适配体和siRNA两者(形成复合物的一部分)均被内化在癌细胞中时几乎完全无效(图10)。这指示了单独的适配体的治疗效率(图3B)，而且还指示了适配体与功能性物质即siRNA的组合的治疗效率(图10)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种特异性结合EphA2的RNA适配体，所述RNA适配体：(i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者可替代地，(ii)由序列SEQ ID NO:1组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶部分是取代的嘧啶；或者可替代地，(iii)包含序列SEQ ID NO:1，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶部分是取代的嘧啶；其中所述术语“取代的嘧啶”当所述核苷酸是胞嘧啶时是式(I)的嘧啶，或当所述核苷酸是尿嘧啶时是式(II)的嘧啶，其中与形成式(I)或式(II)的嘧啶环的碳或氮原子中的至少一个结合的至少一个氢基团被非氢基团取代。2.根据权利要求1所述的RNA适配体，其包含SEQ ID NO:2或由其组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶。3.根据权利要求1
‑
2中任一项所述的RNA适配体，其包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的RNA适配体，其中所述核苷酸序列的所有嘧啶部分是取代的嘧啶。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的RNA适配体，其中所述取代的嘧啶在2'位包含一个非氢基团。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的RNA适配体，其中所述非氢基团选自卤素、
‑
NR1R2、
‑
O
‑
(C1‑
C6)烷基、
‑
SR3、叠氮化物、以及任选地被
‑
OH取代的(C1‑
C6)烷基，其中R1、R2和R3选自
‑
H、(C1‑
C6)烷基和(C1‑
C6)烯基；特别是卤素。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的RNA适配体，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。8.一种复合物，其包含与功能性物质偶联的根据权利要求1
‑
7中任一项所定义的RNA适配体。9.根据权利要求8所述的复合物，其中所述RNA适配体通过间隔子与所述功能性物质偶联，所述间隔子优选地由2
‑
5个核苷酸组成。10.根据权利要求9所述的复合物，其中所述间隔子由3个核苷酸组成。11.根据权利要求8
‑
10中任一项所述的复合物，其中形成所述间隔子的部分或所有所述核苷酸是嘧啶核苷酸。12.根据权利要求8
‑
11中任一项所述的复合物，其中所述功能性物质选自：(i)siRNA、微RNA、shRNA或核酶，优选地siRNA或微RNA；(ii)选自以下的部分：放射性核素、化学治疗剂及其组合，优选地化学治疗剂；以及
(iii)可检测标记；优选地，所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、电子密标记、用于磁共振成像的标记、放射性物质及其组合。13.根据权利要求8
‑
12中任一项所述的复合物，其中所述功能性物质是siRNA。14.根据权利要求13所述的复合物，其中形成所述siRNA的一部分的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸，特别地，所述修饰的核苷酸是修饰的胞嘧啶或尿嘧啶，更特别地，形成所述siRNA的至少一个胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸的所述嘧啶是取代的嘧啶，其中所述术语“取代的嘧啶”根据权利要求1中所定义。15.根据权利要求8
‑
14中任一项所述的复合物，其中所述功能性物质是包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:10的序列的siRNA。16.根据权利要求8
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15中任一项所述的复...

【专利技术属性】
技术研发人员：ó，
申请(专利权)人：阿尔巴，
类型：发明
国别省市：