一种非天然茶碱RNA分子开关制造技术

本发明专利技术公开了一种非天然茶碱RNA分子开关，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过设计随机序列获得一系列非天然茶碱核糖开关，以绿色荧光蛋白基因为目的基因，通过对本底荧光强度/OD600、诱导后荧光强度/OD600和诱导率三个指标综合评价筛选，得到了一种可调控外源蛋白表达的茶碱核糖开关2nt。当茶碱核糖开关2nt与启动子P43组合时，诱导水平高与不含有茶碱核糖开关的表达水平相近，诱导率达到6.5倍。当以天冬氨酶和β

【技术实现步骤摘要】
一种非天然茶碱RNA分子开关


[0001]本专利技术涉及一种非天然茶碱RNA分子开关，属于基因工程


技术介绍

[0002]基因调控在蛋白质表达工程、代谢工程以及合成生物学领域当中多有应用，目前基因调控主要基于诱导型启动子、转录因子等进行。近年，发现了一类在细菌中存在的RNA调控元件——核糖开关。核糖开关是一类首先在细菌5
’
非编码区发现的RNA元件，结构简单，由适体域和表达平台域组成，可在转录翻译过程中直接感知特异小分子浓度等变化来进行高效、准确的调控。因其调控过程中不需要蛋白因子的参与等优点逐渐引起研究人员的兴趣。
[0003]核糖开关由一个可以响应高亲和力配体的适体域(Aptamer)和表达平台域组成；通过利用适体域区域固有的三级结构来识别特异性的配体并结合配体，能够感知配体的浓度。核糖开关在转录水平和翻译水平均可实现调控，转录水平的调控是通过在表达平台域形成终止子或者抗终止子影响RNA聚合酶的功能，从而引起转录的终止或激活；翻译水平的调控通过配体和适体域的结合改变茎环结构，从而暴露或者隐藏SD序列，激活或终止翻译的进行。核糖开关现已在大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等其他菌株中作为调控元件调控外源基因的表达。
[0004]天然核糖开关的适体域往往序列冗长，形成的二级结构和高级结构较复杂，需要利用基因工程手段来简化序列构成，以促进在构建诱导型基因表达系统中的应用。然而，这种通过压缩序列简化天然核糖开关序列的策略往往导致核糖开关功能降低，甚至失能。为了解决这种问题，最近研究者利用体外SELEX的方法筛选出了能够结合茶碱的人工RNA适配体。这种适配体具有序列较短，结构简单，与茶碱配体结合能力强等特点。随后，这种适配体迅速被用于多种核糖开关的设计和构建中，包括了在转录水平和翻译水平的多种人工核糖开关，并应用于重组蛋白表达和代谢工程领域。然而，现有的核糖开关无论是在转录水平还是翻译水平发挥功能，均出现本底渗漏高、诱导水平低的问题，导致整体诱导率不高。而诱导率又是评价诱导型基因表达系统作用严谨性的重要指标。因此，提供一种更加严谨、作用水平更高的人工核糖开关对于蛋白质表达工程领域、代谢工程领域以及合成生物学领域有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种RNA分子开关，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种调控元件，所述调控元件组合包括所述RNA分子开关和启动子；其中，RNA分子开关位于启动子转录起始位点下游。
[0007]在一种实施方式中，所述启动子包括P43、P
veg
、P
spoVG
、P
ylbp
和P
glpD
。
[0008]在一种实施方式中，所述启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，启动子P
ylbp
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，启动子P
veg
的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，启动
子P
spoVG
的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，启动子P
glpD
的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种载体，所述载体携带所述RNA分子开关或调控元件。
[0010]在一种实施方式中，所述茶碱核糖开关位于载体启动子转录起始位点下游。
[0011]在一种实施方式中，所述载体包括载体pBP43
‑
GFP。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种蛋白表达系统，所述系统携带所述调控元件或所述载体。
[0013]在一种实施方式中，所述蛋白表达系统以枯草芽孢杆菌为宿主。
[0014]在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌B.subtilis 168。
[0015]本专利技术的第五个目的是提供一种调控目的蛋白表达的方法，所述方法为在所述调控元件下游连接目的基因后构建至载体，在细胞中表达；通过在细胞培养过程中添加茶碱，调控目的蛋白表达。
[0016]在一种实施方式中，添加终浓度为2
‑
10mM的茶碱溶液。
[0017]在一种实施方式中，目的基因包括酶。
[0018]在一种实施方式中，枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis WB800或Bacillus subtilis pWB980。
[0019]本专利技术还提供上述方法在制备目的蛋白中的应用。
[0020]本专利技术还提供上述方法在食品、化工或制药领域的应用。
[0021]本专利技术还提供上述RNA分子开关、上述调控元件、上述载体或上述蛋白表达系统在制备目的蛋白中的应用。
[0022]本专利技术还提供上述RNA分子开关、上述调控元件、上述载体或上述蛋白表达系统在食品、化工或制药领域的应用。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本专利技术通过设计随机序列获得一系列非天然茶碱核糖开关，以绿色荧光蛋白基因为目的基因，通过对本底荧光强度/OD600、诱导后荧光强度/OD600和诱导率三个指标综合评价筛选，得到了一种可调控外源蛋白表达的茶碱核糖开关2nt。当茶碱核糖开关2nt与启动子P43组合时，诱导水平高与不含有茶碱核糖开关的表达水平相近，诱导率达到6.5倍；与启动子P
glpD
组合时，诱导率达到4.5倍；与启动子P
veg
、P
spoVG
或P
ylbp
组合时，几乎没有本底荧光的表达。当以天冬氨酶和β
‑
葡糖醛酸苷酶基因为目的基因时，加入4mM茶碱溶液，可以使两种酶均成功受诱导而表达，酶活达到23.6U/mL、124.5U/mL。该过程中不需要其他蛋白因子的参与，并且能够有效快速地实现基因调控。
附图说明
[0025]图1：茶碱核糖开关随机序列设计示意图。
[0026]图2：茶碱核糖开关的筛选。根据本底荧光强度/OD600、诱导后荧光强度/OD600和诱导率三个指标综合评价筛选茶碱核糖开关。
[0027]图3：茶碱核糖开关2nt与启动子组合验证。P43,PylbP,Pveg,PspovG与PglpD启动子分别与2nt组合，在有茶碱和无茶碱诱导下GFP表达的荧光强度。
[0028]图4：SDS
‑
PAGE蛋白电泳图。检测PylbP,Pveg,PspovG与PglpD启动子分别与2nt组
合后，在有4mM茶碱和无茶碱诱导下GFP蛋白质表达水平。
[0029]图5：天冬氨酸酶(AspA)和β
‑
葡糖醛酸苷蛋白质表达水平。
[0030]图6：天冬氨酸酶和β
‑
葡萄糖苷酸酶的酶活测定。
具体实施方式
[0031](一)培养基
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA分子开关，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种调控元件，其特征在于，所述调控元件组合包括所述RNA分子开关和启动子；其中，RNA分子开关位于启动子转录起始位点下游。3.根据权利要求2所述的调控元件，其特征在于，所述启动子包括P43、P
veg
、P
spoVG
、P
ylbp
和P
glpD
；所述启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，启动子P
ylbp
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，启动子P
veg
的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，启动子P
spoVG
的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，启动子P
glpD
的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。4.一种载体，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，崔文璟，程锦涛，林巧，周丽，刘中美，郭军玲，刘续，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：