一种体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种体外筛选PD

【技术实现步骤摘要】
一种体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法,特别涉及一种体外筛选广谱肿瘤标志物程序性细胞死亡受体1-配体1(PD-L1)的高亲和力和特异性的DNA核酸适配体的方法及其在肿瘤组织切片PD-L1表达水平测定中的应用，属于生物


技术介绍

[0002]程序性细胞死亡受体1(PD-1)是一种细胞表面受体，I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在T细胞和pro-B细胞上表达。PD-1是免疫检查点，通过两种机制防止自身免疫。首先，它促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，它减少了调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)的细胞凋亡。PD-1结合两个配体，程序性细胞死亡受体1-配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡受体1-配体2(PD-L2)。PD-L1主要表达于树突状细胞等抗原递呈细胞及各种肿瘤细胞。正常情形下，免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生。而PD-1与PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，减低T细胞的活化和增生，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。PD-1和PD-L1均可作为靶点，其抗体均已经证实可以增强抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活率。目前，市面上基于阻断PD-L1/PD-1结合，进行癌症治疗的抗体药物包括K药Pembrolizumab(Clin.Cancer Res.2017,23,5666
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5670)、O药和T药(Atezolizumab)。r/>[0003]如何筛选可能获益于PD-1/PD-L1抑制剂疗法的患者是临床最关注的问题。PD-L1免疫组化检测是预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的一种简单有效的方法。目前，已被FDA/NMPA批准的PD-1/PD-L1抑制剂的适应症包括肺癌、黑色素瘤和尿路上皮癌等。作为PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂药物的疗效预测标志，PD-L1检测已经获FDA批准作为免疫治疗的伴随诊断或补充诊断。目前，PD-L1免疫组化检测试剂盒/抗体主要有五种：22C3、28-8、SP263、SP142和73-10，分别在两个免疫组化平台Dako和Ventana进行检测。目前，PD-L1免疫组化检测技术面临以下主要检测难题。(1)不同抗体要求使用不同的检测平台。比如22C3和28-8抗体检测使用DAKO AutoStainer Link 48平台，而SP142和SP263抗体检测使用Ventana Ventana Benchmark Ultra平台。(2)不同的抗体检测结果判读标准不同，而且PD-L1的判读需要专业的病理医生经过大量的训练才能保证判读的准确性。(3)不同抗体的检测结果存在差异。比如虽然已有研究证明28-8、22C3和SP263的检测结果一致性较高，但也仅是特定肿瘤类型的比较，在个别瘤种间，不同抗体型号的检测结果仍有不小的差异。另外抗体还存在价格昂贵，稳定性差容易失活，批次间性能差异大等缺点。
[0004]核酸适配体(aptamer)是一类可以特异性结合各类靶标分子的短链核苷酸序列(RNA或者DNA)，通常通过被称为SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)的体外筛选技术获得(Science,1990,249,505-510)。SELEX是从化学合成的随机核酸文库中通过对靶标分子的多轮亲和富集，筛选出具有高亲和力和特异性的核酸适配体的一种体外筛选技术。与抗体相比，核酸适配体具有保质期长、稳定性高、批次间变异较小、低或无免疫原性、成本低、化学修饰便捷等优点(Biotechnol.Adv.2018,
37,28-50)，在肿瘤诊断领域已经展现出很好的应用前景。但目前还没有基于核酸适配体的PD-L1检测试剂盒及应用于人癌症组织切片PD-L1表达水平检测的相关文献报道。
[0005]传统的SELEX技术利用醋酸纤维素膜来分离与蛋白质靶标结合的核酸适配体。为了提高核酸适配体的筛选效率和性能，目前已经报道了多种改良的SELEX技术，例如MCP-SELEX(Anal.Chem.2019,91,13383-13389)、Capture-SELEX(Proceedings of the National Academy of Sciences 2006,103,11838-11843)、Tissue-SELEX等(Int.J.Mol.Sci.2017,18,2142-2160)。这些体外筛选技术各自具有其优越性和局限性。比如，MCP-SELEX技术中靶标和文库都处于天然的自由状态，没有在固相上固定，因此可以快速实现文库的亲和富集。但是该技术不方便对复杂基质进行负筛选，不能消除与不具有氨基官能团的干扰物结合的序列。Capture-SELEX通常以磁珠为固定相进行靶标或者文库的固定，便于结合序列和未结合序列的分离，操作便捷，特别是便于负筛选的进行。但是由于固相固定会极大地影响靶标的二级结构，而文库固定时无法避免文库自解离现象，固相上还会产生非特异性的吸附，还存在界面位阻，这些因素都会导致富集效果不佳，需要多轮筛选，而且会限制核酸适配体的亲和力和特异性。Tissue-SELEX(The Journal of Pathology:A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland 2009,218(3),327-336)分别使用细胞或者组织切片进行核酸适配体的筛选，靶标蛋白处于生物体中固有的状态，因而所筛选出来的核酸适配体能够很好的识别实际生物样本中的靶标蛋白。但是由于细胞或组织切片较为复杂，因此容易在筛选过程中出现对非目的靶标有亲和力的序列的富集，造成富集效率不高等缺点。因此，目前没有任何一种单一的SELEX技术同时具备操作简便、富集效率高、便于负筛选、对真实样本兼容性好这些优点。
[0006]目前已有公开报道的人源PD-L1的DNA核酸适配体，分别利用传统的基于醋酸纤维素膜的SELEX(Molecular Therapy—Nucleic Acids,2016,5,e397)或者基于靶标固定的MB-SELEX技术(Microchim Acta 2017,184,4029-4035)筛选获得，但均未应用于人癌症组织切片的PD-L1表达水平检测。2018年美国学者报道了利用化学修饰文库，基于文库修饰微珠筛选的PD-L1的DNA核酸适配体，将其应用于人前列腺癌组织切片的荧光成像，但缺乏阴性对照，而且未公开核酸适配体的序列信息和化学修饰信息(Biochimie 2018,145,125-130)。

技术实现思路

[0007]本专利技术涉及一种体外筛选广谱肿瘤标志物程序性细胞死亡受体1-配体1(PD-L1)的高亲和力和特异性的DNA核酸适配体的新方法，简称模块化-SELEX(Modular-SELEX)。本方法的起始随机DNA文库包含两个随机序列区域和位于中间的固定区域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法，其特征在于，本方法为模块化-SELEX，本方法的起始随机DNA文库包含两个随机序列区域和位于中间的固定区域。2.根据权利要求1所述的体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法，其特征在于，本发明方法按照先提高核酸适配体亲和力，再提高其特异性，最后提高其对真实样本中靶标检测的兼容性的步骤，包括三个技术模块，每个技术模块采用一种SELEX技术。3.根据权利要求2所述的体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、首先利用MCP-SELEX进行三轮筛选，以达到快速提高文库亲和力的目的；步骤二、随后进行三轮Capture-SELEX，以高浓度组氨酸标记的人血清白蛋白为靶标进行负筛选，提高文库的特异性；步骤三、最后进行两轮Tissue-SELEX，提高文库对真实样本中靶标检测的兼容性，最终获得对真实样本中PD-L1具有好的识别能力的DNA核酸适配体。4.根据权利要求3所述的体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法，其特征在于，步骤一具体操作步骤如下：步骤1.DNA文库热处理：DNA文库稀释在500μL的筛选缓冲溶液(50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，100mM NaCl，1mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2，pH 7.4)中，95℃水浴加热10分钟，冰上猝冷10分钟，放置室温10分钟；步骤2.羧基包被的磁珠活化：步骤2.1.将羧基包被的磁珠室温下旋转混匀15分钟；步骤2.2.吸取10μL磁珠与100μL 25mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，pH 5.0)充分混合10分钟后舍弃上清液，再用100μL 25mM的MES溶液清洗两次；步骤2.3.用25mM的MES溶液分别新鲜配置50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和50mg/mL的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液；步骤2.4.加100μL的上述EDC溶液和100μL的上述NHS溶液于2.2清洗过后的磁珠中，充分混匀，室温下低速摇匀30分钟；步骤2.5.将含有EDC/NHS/磁珠的离心管放置于强力磁铁上1分钟，移去上清液后用100μL 25mM的MES溶液清洗2次；步骤2.6.在上述活化后的磁珠中加入10μL筛选缓冲溶液，使磁珠均匀分散在溶液中；步骤3.与活化磁珠的负筛选：将1中热处理后的DNA文库加入到活化后的磁珠中，总体积为500μL，室温下旋转混均孵育30分钟；孵育结束后弃磁珠，留上清液；步骤4.负筛选后文库与靶标蛋白PD-L1的孵育：向3中所收集的上清液中加入PD-L1，室温下旋转混均孵育30分钟；孵育结束后弃上清液，留磁珠；向磁珠中加入200μL筛选缓冲溶液，室温下旋转混均孵育5分钟，置于强力磁铁上1分钟，重复清洗4次；最后，加入120μL筛选缓冲溶液，在95℃下震荡加热20分钟，磁力分离1分钟，收集上清液(洗脱液)；步骤5.对洗脱液中DNA序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列，使用生物素标记的反向引物；步骤6.制备DNA单链：步骤6.1.制备柱子：将链霉亲和素琼脂糖凝胶珠置于旋转仪上室温旋转15分钟，在200μL防气溶胶枪头中加入60μL链霉亲和素琼脂糖凝胶珠，用200μL含1M(摩尔每升)NaCl的磷
酸盐缓冲溶液(1
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PBS/1M NaCl)清洗柱子；步骤6.2.过柱子：用移液枪分批将PCR混合液加入柱中(每次100μL)，利用移液枪施加压力使PCR混合液与链霉亲和素琼脂糖凝胶珠充分混合，3分钟后用移液枪施压将柱中的混合液排出枪头，随后用200μL 1
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PBS/1M NaCl对柱子进行清洗；重复此操作，直至PCR溶液全部加入柱中；步骤6.3.NaOH洗脱：用200μL 1
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PBS/1M NaCl洗涤两次柱子后，用移液枪将100μL 30mM NaOH加入柱子中，5分钟后用移液枪施压将该NaOH溶液排出柱子，收集到干净的离心管中，即单链DNA文库；步骤6.4.文库定量：将上述单链DNA文库用等量HCl中和，通过测定260nm(纳米)处的紫外可见吸收强度进行浓度定量。5.根据权利要求3所述的体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法，其特征在于，步骤二具体操作步骤如下：步骤1.DNA文库杂交与热处理：按照DNA文库与cDNA物质的量比为1：5于B&W缓冲溶液(10mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH＝7.4)中配制100μL DNA溶液；将上述溶液于95℃水浴加热10分钟,缓冷至室温；步骤2.清洗MyOne
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链霉亲和素C1包被的磁珠：将磁珠室温混匀15分钟，吸取44μL磁珠，用100μL B&W缓冲溶液混匀，放于强力磁铁上静置1分钟，舍弃上清液，重复操作两次；步骤3.将热处理好的DNA溶液与磁珠混合，室温旋转孵育30分钟；步骤4.孵育结束后，在强力磁体上静置1分钟，舍弃上清液；用150μL筛选缓冲溶液清洗磁珠4次，最后用筛选缓冲溶液定容至150μL；步骤5.与负筛孵育：向上述溶液中加入75pmol(皮摩尔)组氨酸标记的人血清白蛋白混合，室温孵育1小时；步骤6.孵育结束后，在强力磁体上静置1分钟，舍弃上清液(也可将上清液放于另一新离心管中保留)；用150μL筛选缓冲溶液清洗磁珠4次，最后用筛选缓冲溶液定容至150μL；步骤7.与目的靶标孵育：向上述溶液中加入15pmol PD-L1混合，室温孵育1小时；步骤8.孵育结束后，在强力磁体上静置1分钟，收集上清液放于新的离心管中；步骤9.对上清液中DNA序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列，使用生物素标记的反向引物；步骤10.制备DNA单链。6.根据权利要求4所述的体外筛选PD-L1的DNA核酸适配体的方法，其特征在于，步骤三如下：使用石蜡包埋的PD-L1高表达非小细胞型肺癌(NSCLC)组织切片，具体操作步骤如下：步骤1.DNA文库热处理：DNA文库稀释在150μL的筛选缓冲溶液中，95℃水浴加热10分钟，冰上猝冷10分钟，放置室温10分钟；步...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄新徽，李济远，任惜娇，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：