抑制间充质干细胞复制性衰老的方法技术

本发明专利技术公开了抑制间充质干细胞复制性衰老的方法。hUC

【技术实现步骤摘要】
抑制间充质干细胞复制性衰老的方法


[0001]本专利技术属于干细胞领域，涉及干细胞培养，具体为抑制间充质干细胞复制性衰老的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSCs)广泛存在于多种组织中，包括骨髓、脂肪、胎盘等。由于其能够自我更新及多向分化，并表现出旁分泌、免疫调节等多种功能，MSCs被认为是细胞治疗最具应用前景的种子细胞。目前MSCs疗法可以作为一种新兴疗法用于治疗骨/软骨疾病、肾病、糖尿病、神经系统疾病以及免疫性疾病。
[0003]人脐带间充质干细胞(hUC
‑
MSCs)作为MSCs中一员，不仅具有高度自我更新能力和多向分化潜能，而且不存在伦理问题，应用前景广阔。
[0004]hUC
‑
MSCs复制性衰老是hUC
‑
MSCs体外培养过程不可避免的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供抑制间充质干细胞复制性衰老的方法。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]提高FOSL1蛋白表达水平用于间充质干细胞体培养抑制其复制性衰老的用途。SA
‑
β
‑
Gal染色试验中，与模型对照组相比，FOSL1低激活组、FOSL1高激活组阳性细胞率显著降低，且FOSL1高激活组阳性细胞率显著低于FOSL1低激活组阳性细胞率。
[0008]优选地，所述间充质干细胞为hUC
‑
MSCs。
[0009]优选地，提高FOSL1蛋白表达水平的化合物包括环(酪氨酸
‑
缬氨酸)。环(酪氨酸
‑
缬氨酸)可能通过作用于靶点FOSL1蛋白抑制hUC
‑
MSCs复制性衰老，且不破坏hUC
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MSCs的干细胞特性。
[0010]有益效果：
[0011]hUC
‑
MSCs复制性衰老是hUC
‑
MSCs体外培养过程不可避免的问题。本专利技术发现，提高FOSL1蛋白表达水平可以发挥抗hUC
‑
MSCs衰老的作用，环(酪氨酸
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缬氨酸)可能正是以FOSL1蛋白为靶点抑制hUC
‑
MSCs复制性衰老。
附图说明
[0012]图1中：(A)SA
‑
β
‑
Gal染色图；(B)westernblot图；(C)茜素红和油红O染色图。
具体实施方式
[0013]一、实验材料
[0014]青霉素/链霉素、胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司，胎牛血清、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、
HLA
‑
DR购自美国BioLegend。环(酪氨酸
‑
缬氨酸)纯度98％，购自武汉天植生物技术有限公司。人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基购自深圳市伟通生物科技有限公司。
[0015]二、实验方法
[0016]1、hUC
‑
MSCs的分离和培养
[0017]取新生儿脐带，在无菌操作环境下，用含1％青霉素/链霉素的的PBS反复冲洗，保留沃顿胶，剪碎后均匀分散平铺于培养皿中，加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2～3天换液1次，待细胞克隆长至约85％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化并传代。取第3代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化重悬至1.5
×
106/ml，各管分别加入萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR，同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育45min，用PBS洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
[0018]2、自然传代制备复制性衰老模型、分组
[0019]取第3代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化重悬，用完全培养基培养，每2～3天换液1次，待细胞克隆长至约85％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化并传代。取第6代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化重悬，分组如下：
[0020]模型对照组：使用完全培养基继续培养；
[0021]FOSL1低激活组：使用含有2.5μg/mL环(酪氨酸
‑
缬氨酸)的完全培养基继续培养；
[0022]FOSL1高激活组：使用含有10μg/mL环(酪氨酸
‑
缬氨酸)的完全培养基继续培养。
[0023]继续培养至12代收集细胞进行后续实验。
[0024]3、SA
‑
β
‑
Gal染色法测定衰老细胞比例
[0025]取模型对照组、FOSL1低激活组、FOSL1高激活组细胞分别铺于6孔板中，约85％融合时，用细胞固定液固定15min，按照SA
‑
β
‑
Gal染色试剂盒说明书配制染色液，每孔加入2mL染色液，置于37℃、无CO2环境中孵育过夜，光学显微镜下观察细胞染色情况。各组随机选取5个视野，计算染色阳性细胞率。
[0026]4、western blot测定靶蛋白表达水平
[0027]取模型对照组、FOSL1低激活组、FOSL1高激活组细胞，加入细胞裂解液混匀后冰上裂解40min，离心收集上清，BCA法检测蛋白浓度。取等量总蛋白进行SDS
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PAGE电泳，转膜、封闭后，加入FOSL1、β
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Actin一抗，于4℃孵育过夜，次日加入相应的二抗，室温避光孵育120min，PBST洗去未结合的二抗，用化学发光显色后进行图像分析，采用Image J软件对显影的条带进行灰度分析。
[0028]5、干细胞特性测定
[0029]5.1干细胞表面标志物测定
[0030]取FOSL1高激活组细胞，用0.25％胰蛋白酶消化重悬至1.5
×
106/ml，各管分别加入萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR，同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育45min，用PBS洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
[0031]5.2多向分化能力测定
[0032](1)成骨分化诱导
[0033]取FOSL1高激活组细胞，用人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养14d，弃去上清液，PBS洗涤3次，加入4℃多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次，加入茜素红染色1h，显微镜下观察红色结节，并拍照记录。以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高FOSL1蛋白表达水平用于间充质干细胞体培养抑制其复制性衰老的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述间充质干细胞为hUC
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【专利技术属性】
技术研发人员：于海涛，
申请(专利权)人：南京赛尔健生物技术有限公司，
类型：发明
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