FABP4在促进骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了FABP4在促进骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化中的应用。本发明专利技术发现，FABP4高表达的骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和骨向分化能力，促进FABP4表达具有促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化的作用。因此，促进FABP4表达的物质可用于制备促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化的培养基。间充质干细胞体外增殖与骨向分化的培养基。间充质干细胞体外增殖与骨向分化的培养基。

【技术实现步骤摘要】
FABP4在促进骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化中的应用


[0001]本专利技术涉及干细胞领域，涉及干细胞培养和诱导分化，具体涉及FABP4在促进骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化中的应用。

技术介绍

[0002]临床上许多疾病会导致骨骼破坏，进而造成骨缺损，骨再生是近年来临床上的研究热点与难点。在治疗骨缺损的策略上，骨组织材料不断创新，从最开始的自体骨到后期同种异体骨等材料，但由于自体骨的获取会增加患者的手术创伤，且往往获取量受限而在临床上应用受到一定的限制，异体骨由于其免疫排斥性，也给临床应用带来了一定的困扰。骨组织工程对骨缺损修复至关重要，用于骨缺损治疗的骨组织工程材料主要由两部分构成，即具有骨传导、骨诱导特性的生物支架材料和各类成骨诱导因子或种子细胞。由于骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种来源简便、分化能力强的细胞，因而成为目前研究的热点。
[0003]脂肪酸结合蛋白(fatty acid
‑
binding proteins，FABPs)是一组同源低分子量细胞内脂质结合蛋白，分子量为14
‑
15kD，含125
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134个氨基酸，可作为脂肪分子伴侣参与细胞内脂肪酸转运及其他信号传导通路过程。FABP4是FABPs家族中最具特征的细胞内脂质转运蛋白之一，在能量代谢与炎症中起中心调控作用。FABP4基因定位于染色体8q21，由4个外显子和3个内含子组成，包括3个顺向和1个倒置的脂肪特异性增强子1元件、1个脂肪特异性增强子2元件和1个甘油
‑3‑/>磷酸脱氢酶基因，其相对分子量14588D。FABP4在多种细胞中均可表达，参与多种生物学过程，如细胞的生长、分化、凋亡、代谢和炎症等过程。
[0004]目前没有FABP4与骨髓间充质干细胞增殖分化的相关性报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了提供FABP4在促进骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化中的应用。
[0006]实现上述目的的技术方案如下：
[0007]促进FABP4表达在促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化中的应用。
[0008]促进FABP4表达的物质在制备促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化的培养基中的应用。
[0009]有益效果：
[0010]本专利技术发现，FABP4高表达的骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和骨向分化能力，促进FABP4表达具有促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化的作用。因此，促进FABP4表达的物质可用于制备促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化的培养基。
附图说明
[0011]图1为倒置显微镜下观察的细胞生长形态；
[0012]图2为western blot检测结果；
[0013]图3为茜红素染色结果。
具体实施方式
[0014]一、试验材料
[0015]人骨髓间充质干细胞购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。
[0016]人骨髓间充质干细胞完全培养基购自上海雅吉生物科技有限公司。
[0017]人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
[0018]携带GFP报告基因和FABP4基因的腺病毒Ad
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FABP4、仅携带GFP报告基因的腺病毒Ad
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GFP由汉恒生物科技(上海)有限公司构建。PCR引物委托上海生工合成。
[0019]总RNA提取试剂盒购自北京凯诗源生物科技有限公司，逆转录试剂盒购自TAKARA公司，FABP4抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自中杉金桥公司。
[0020]CCK8试剂盒购自同仁化学。
[0021]茜红素染液为人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基附带。
[0022]二、试验方法
[0023]1、人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)复苏培养和鉴定
[0024]将冻存的hBMSCs按照常规方法复苏后用人骨髓间充质干细胞完全培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，每3d换液1次，于倒置显微镜下观察细胞生长形态。
[0025]2、分组、基因转染和RT
‑
PCR、western blot验证
[0026]取生长状态良好的hBMSCs分为正常对照组、FABP4转染组和转染对照组。正常对照组的hBMSCs不进行转染操作，FABP4转染组的hBMSCs转染携带GFP报告基因和FABP4基因的腺病毒Ad
‑
FABP4，转染对照组hBMSCs转染仅携带GFP报告基因的腺病毒Ad
‑
GFP。基因转染操作按常规腺病毒转染操作方法进行，先将生长状态良好的hBMSCs接种于6孔板，待细胞汇合至75％左右时，进行腺病毒感染，感染4h后弃去培养基，PBS洗涤，更换为新的人骨髓间充质干细胞完全培养基，24h后在荧光倒置显微镜下观察出现绿色荧光代表转染成功。转染成功后使用RT
‑
PCR检测各组hBMSCs中FABP4 mRNA表达，使用western blot检测各组hBMSCs中FABP4蛋白的表达。
[0027]RT
‑
PCR检测各组hBMSCs中FABP4 mRNA表达：
[0028]收集各组hBMSCs，用总RNA提取试剂盒分别提取总RNA，进行逆转录获得cDNA，以此为模板进行扩增反应。GAPDH为内参。引物设计和PCR反应程序参照文献(脂肪酸结合蛋白4在同型半胱氨酸致肝细胞脂质沉积中的作用，宁夏医科大学学报，2020)。2
‑
ΔΔCt
法计算FABP4 mRNA的相对表达水平，以正常对照组FABP4 mRNA相对表达水平计为1。
[0029]western blot检测各组hBMSCs中FABP4蛋白表达：
[0030]收集各组hBMSCs，总蛋白提取试剂盒分别提取总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，上样30μg，行十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)，100V1.5h后将蛋白转移至PVDF膜，配制5％脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2h，洗膜后用兔抗人FABP4一抗(1:1000)4℃孵育过夜，继续洗膜后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1:5000)室温孵育2h，洗膜3次，加ECL混合溶液，曝光、显影，以β
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actin作为内参。
[0031]3、CCK8法测定hBMSCs增殖活性
[0032]取生长状态良好的hBMSCs，按上述方法分组、转染，获得正常对照组、FABP4转染组
和转染对照组hBMSCs。消化，洗涤，用人骨髓间充质干细胞完全培养基重悬，制成密度为5
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104/mL的细胞悬浮液，按照每孔100μL的接种量接种于96孔板，每组5个复孔，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.促进FABP4表达在促进骨髓间充质干细胞体外增殖与骨向分化中的应用。2.促进FABP...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海涛，
申请(专利权)人：南京赛尔健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：