一种microRNA在促进人脐带间充质干细胞体外扩增中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种microRNA在促进人脐带间充质干细胞体外扩增中的应用。CCK法测定结果显示，miR

【技术实现步骤摘要】
一种microRNA在促进人脐带间充质干细胞体外扩增中的应用


[0001]本专利技术属于干细胞研究领域，涉及人脐带间充质干细胞的体外培养，具体涉及一种microRNA在促进人脐带间充质干细胞体外扩增中的应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSCs)广泛存在于多种组织中，包括骨髓、脂肪、胎盘等。由于其能够自我更新及多向分化，并表现出旁分泌、免疫调节等多种功能，MSCs被认为是细胞治疗最具应用前景的种子细胞。目前MSCs疗法可以作为一种新兴疗法用于治疗骨/软骨疾病、肾病、糖尿病、神经系统疾病以及免疫性疾病。
[0003]人脐带间充质干细胞(hUC
‑
MSCs)作为MSCs中一员，不仅具有高度自我更新能力和多向分化潜能，而且不存在伦理问题，应用前景广阔。
[0004]如何提高hUC
‑
MSCs体外扩增活性是hUC
‑
MSCs研究领域的重要问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种microRNA在促进人脐带间充质干细胞体外扩增中的应用。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]提高人脐带间充质干细胞中miR
‑
609表达水平在提高人脐带间充质干细胞体外扩增活性中的应用。CCK法测定结果显示，过表达组细胞扩增活性显著高于空白对照组，阴性对照组细胞扩增活性未见明显提高；细胞克隆结果显示，过表达组细胞克隆数显著高于空白对照组，阴性对照组细胞克隆数未见明显增加。CCK试验和细胞克隆试验是检测细胞增殖活性的经典方法，这两项结果说明miR
‑
609过表达细胞的体外扩增活性显著提高。
[0008]一种提高人脐带间充质干细胞体外扩增活性的培养基，含有提高人脐带间充质干细胞中miR
‑
609表达水平的成分。
[0009]进一步地，所述培养基包括DMEM/F12基础培养基和提高人脐带间充质干细胞中miR
‑
609表达水平的成分。
[0010]有益效果：
[0011]本专利技术发现，miR
‑
609过表达可以有效提高hUC
‑
MSCs的体外扩增活性，因此可以通过提高miR
‑
609的表达水平提高hUC
‑
MSCs的体外扩增效率。
附图说明
[0012]图1中A是qRT
‑
PCR检测结果，过表达组miR
‑
609相对表达量显著高于空白对照组，阴性对照组miR
‑
609相对表达量未见明显提高；B是CCK测定结果，过表达组细胞扩增活性显著高于空白对照组，阴性对照组细胞扩增活性未见明显提高；C是细胞克隆试验结果，过表达组细胞克隆数显著高于空白对照组，阴性对照组细胞克隆数未见明显增加。
具体实施方式
[0013]一、实验材料
[0014]双抗、胰酶购自美国Invitrogen公司，胎牛血清、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，CCK
‑
8检测试剂盒、Lipofectamine
TM 2000购自碧云天，总RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，引物由上海生工设计合成，miR
‑
609mimics、miR
‑
609NC(negative control)由上海吉玛基因制药技术有限公司设计并合成。萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR购自美国BioLegend。
[0015]二、实验方法
[0016]1、hUC
‑
MSCs的分离和培养
[0017]取新生儿脐带，在无菌操作环境下，用含1％双抗的PBS反复冲洗，保留沃顿胶，剪碎后均匀分散平铺于培养皿中，加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2～3天换液1次，待细胞克隆长至约85％融合时，用0.25％胰酶消化并传代。取第3代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰酶消化重悬至1.5
×
106/ml，各管分别加入萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR，同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育45min，用PBS洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
[0018]2、细胞转染
[0019]收集第3代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰酶消化重悬，接种于6孔板中，培养至细胞基本融合为一层时进行转染。使用转染试剂Lipofectamine
TM 2000按照说明书进行操作，将miR
‑
609mimics(过表达组)和miR
‑
609NC(阴性对照组)分别转染至hUC
‑
MSCs。转染后培养6h，换完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，收集细胞。
[0020]另外设置不进行转染操作的空白对照组。
[0021]3、qRT
‑
PCR检测基因相对表达量
[0022]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，使用抽提试剂盒提取总RNA，取5μg总RNA行反转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应。以U6为内参，miR
‑
609基因的相对表达量以2
－
△△
Ct
表示。PCR反应引物如下。
[0023][0024]4、流式检测表面分子标记物
[0025]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，用0.25％胰酶消化重悬至1.5
×
106/ml，各管分别加入萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR，同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育45min，用PBS洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
[0026]5、CCK法测定体外扩增活性
[0027]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，用0.25％胰酶消化重悬，以每孔8
×
103个接种于96孔板上，每孔100μL，每组设3个重复孔。培养48h，加入CCK8试剂(10μL CCK8试剂+90μL完全培养基)孵育2h，采用酶标仪检测450nm波长处的吸光值(OD
450
)，以空白对照组细胞扩增活性为100％计，按照公式计算过表达组和阴性对照组细胞扩增活性：
[0028]细胞扩增活性(％)＝转染细胞吸光值OD
450
/空白对照细胞吸光值OD
450
×
100％。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高人脐带间充质干细胞中miR
‑
609表达水平在提高人脐带间充质干细胞体外扩增活性中的应用。2.一种提高人脐带间充质干细胞体外扩增活性的培养基，其特征在于：含有提高人脐带间充质干细胞中miR

【专利技术属性】
技术研发人员：于海涛，
申请(专利权)人：南京赛尔健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：