一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液及应用制造技术

本发明专利技术公开一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液及应用，包括NaCl和蔗糖，调pH为1

【技术实现步骤摘要】
一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液及应用


[0001]本专利技术属于医药
，尤其是涉及一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液。

技术介绍

[0002]外泌体(exosomes)是一种直径在30
‑
150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。正是外泌体的结构(磷脂双分子层和囊泡状结构)和生理特性，使它们具有很好的生物相容性。并且外泌体可以自由的穿过血脑屏障（BBB），低免疫原性和毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好、组织和肿瘤靶向性和循环半衰期长等优点，是新型药物递送系统的理性候选者。
[0003]外泌体装载策略大致分两类：被动和主动装载。主动装载中使用最为广泛、稳定性好且具有放大潜力的是使用电穿孔仪装载的策略。电穿孔是利用瞬时电场使外泌体膜磷脂分子发生重排导致产生诸多的小孔，同时利用药物和外泌体在电场中向正极移动的速度不同使药物进入外泌体中，再利用磷脂膜的流动性使小孔恢复完成药物装载。现阶段，常用的电穿孔缓冲液是由英国牛津大学Matthew J A Wood 教授提供的：包含1.15mM磷酸二氢钾和25mM的碘化钾的21%(Vol/Vol, pH=7.2)碘克沙醇溶液。此电穿孔缓冲液配方的K/>+
浓度为26.15 mM，属于高K
+
的缓冲液。正是钾离子浓度过高提升了整个溶液的电导率，极易在高电压的情况下对外泌体产生损伤，破坏了外泌体形态。另外钾离子的浓度过高导致缓冲液的渗透压高于外泌体中的渗透压，也不利于药物的进入。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液及应用。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液，包括包括3
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9mg/ml NaCl或0.1
‑
1mg/ml的KCl，10
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40mg/ml 蔗糖，pH为1
‑
2。
[0006]优选地，pH为2。
[0007]一种细胞外囊泡电穿孔处理方法，用低电导率低渗透压电穿孔缓冲液处理细胞外囊泡。
[0008]优选地，将细胞外囊泡分散在缓冲液中，37℃孵育后进行电穿孔。
[0009]优选地，电穿孔电压为100
‑
250V，电穿孔脉冲时程为3000
‑
5000us。
[0010]优选地，电穿孔电压为150V，电穿孔脉冲时程为4000us。
[0011]优选地，孵育时长1h。
[0012]优选地，所述细胞外囊泡为外泌体。
[0013]细胞外囊泡电穿孔处理方法在细胞外囊泡装载中的应用。
[0014]优选地，装载siRNA。
[0015]本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术提供一种低渗低电导率电穿孔缓冲液，由于其低渗、低电导率的性质，可以达到较高的电穿孔效率；经比较转染效率的试验证明，低渗低电导率缓冲液在用量相同情况下转染效率显著高于高钾离子的缓冲液；另外，本专利技术所公开的低渗低电导率电穿孔缓冲液，配置简便，价格低廉，转染效率显著高，易于推广；本专利技术同时提供一种能够提高细胞外囊泡电穿孔载药效率的电转条件，使用此条件制备的载药外泌体性质未发生明显改变：形态完整、粒径、颗粒数和表面标志物无明显变化，但装载效率要明显更高。
附图说明
[0016]图1si
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EGFP PC
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Cy3功能验证；其中A图为GFP/293T细胞的流式检测；B图为GFP/293T细胞转染si
‑ꢀ
EGFP PC
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Cy3后的流式细胞检测；C图为GFP mRNA的表达检测；图2 si
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EGFP PC
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Cy3定量方法的建立；图3牛奶外泌体鉴定；其中A图为牛奶外泌体的形态学表征；B图为牛奶外泌体的粒径分布检测；C图为牛奶外泌体的纯度检测；图4不同电穿孔电压对外泌体装载si
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EGFP PC
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Cy3的装载效率的影响；图5不同电穿孔脉冲时程对外泌体装载si
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EGFP PC
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Cy3的装载效率影响；图6不同孵育温度对外泌体装载si
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EGFP PC
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Cy3的装载效率影响；图7不同孵育时间对外泌体装载si
‑
EGFP PC
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Cy3的装载效率影响；图8不同电穿孔缓冲液的pH值对外泌体装载si
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EGFP PC
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Cy3装载效率的影响；图9电穿孔后外泌体表征；其中A图为载si
‑
EGFP PC
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Cy3牛奶外泌体的形态学表征；B图为载si
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EGFP PC
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Cy3牛奶外泌体的阳性率检测；图10外泌体载si
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EGFP PC
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Cy3功能验证：其中A图为GFP/293T细胞对外泌体载si
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EGFP PC
‑
Cy3的摄入；其中B图为GFP mRNA的表达检测。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本专利技术做出进一步说明。
[0018]本专利技术公开一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液，能够用于电穿孔过程。缓冲液包括3
‑
9mg/ml NaCl，10
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40 mg/ml 蔗糖，调其pH为1
‑
2；或者，缓冲液可由0.1
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1mg/ml的KCl和10
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40mg/ml 蔗糖组成，调其pH为1
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2。在细胞外囊泡电穿孔处理方法中，可用低电导率低渗透压电穿孔缓冲液处理细胞外囊泡，作用于细胞外囊泡外膜，从而提高其电穿孔效率。具体为将细胞外囊泡分散在缓冲液中，37℃孵育后进行电穿孔，优选孵育1h；电穿孔条件为：电压为100
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250V，脉冲时程为3000
‑
5000us；其中电压优选为150V，脉冲时程优选为4000us。
[0019]小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)也称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20
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25个碱基，类似于miRNA，常用作于细胞内降低靶mRNA的含量。外源siRNA进入到细胞质后，在 Dicer 的帮助下与 AGO2 等结合，构成 siRNA 诱导沉默复合体(siRNA
‑
induced sil本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液，其特征在于：包括3
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9mg/ml NaCl或0.1
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1mg/ml的KCl，10
‑
40mg/ml 蔗糖，pH为1
‑
2。2.根据权利要求1所述的低电导率低渗透压电穿孔缓冲液，其特征在于：pH为2。3.一种细胞外囊泡电穿孔处理方法，其特征在于：用权利要求1或2所述低电导率低渗透压电穿孔缓冲液处理细胞外囊泡。4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡电穿孔处理方法，其特征在于：将细胞外囊泡分散在缓冲液中，37℃孵育后进行电穿孔。5.根据权利要求3或4所述的细胞外囊泡电穿孔处理方...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，程国钢，马德美，田应洲，白云飞，王达，赵刚刚，王淼，
申请(专利权)人：天九再生医学天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：