微小RNA在脐带间充质干细胞抗凋亡中的应用制造技术

本发明专利技术公开了微小RNA在脐带间充质干细胞抗凋亡中的应用。本发明专利技术发现，miR

【技术实现步骤摘要】
微小RNA在脐带间充质干细胞抗凋亡中的应用


[0001]本专利技术属于干细胞研究领域，涉及脐带间充质干细胞的体外培养，具体涉及微小RNA在脐带间充质干细胞抗凋亡中的应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSCs)广泛存在于多种组织中，包括骨髓、脂肪、胎盘等。由于其能够自我更新及多向分化，并表现出旁分泌、免疫调节等多种功能，MSCs被认为是细胞治疗最具应用前景的种子细胞。目前MSCs疗法可以作为一种新兴疗法用于治疗骨/软骨疾病、肾病、糖尿病、神经系统疾病以及免疫性疾病。
[0003]人脐带间充质干细胞(hUC
‑
MSCs)作为MSCs中一员，不仅具有高度自我更新能力和多向分化潜能，而且不存在伦理问题，应用前景广阔。
[0004]如何提高hUC
‑
MSCs体外抗凋亡水平是hUC
‑
MSCs研究中需要解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供微小RNA在脐带间充质干细胞抗凋亡中的应用。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]提高人脐带间充质干细胞中miR
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‑
5p表达水平在提高人脐带间充质干细胞体外抗凋亡活性中的应用。
[0008]有益效果：
[0009]本专利技术发现，miR
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5p过表达可以有效降低hUC
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MSCs的体外凋亡水平，可以通过提高miR
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5p的表达水平提高hUC
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MSCs体外抗凋亡活性。
附图说明
[0010]图1是Annexin
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V和PI染液染色结果。
[0011]图2是Western免疫印迹结果。
具体实施方式
[0012]一、实验材料
[0013]青霉素/链霉素、胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司，胎牛血清、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，CCK
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8检测试剂盒、Lipofectamine
TM 2000购自碧云天，总RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，引物由上海生工设计合成，miR
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5p mimics、miR
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5p NC(negative control)由上海吉玛基因制药技术有限公司设计并合成，萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
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DR购自美国BioLegend。
[0014]二、实验方法
[0015]1、hUC
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MSCs的分离和培养
[0016]取新生儿脐带，在无菌操作环境下，用含1％青霉素/链霉素的的PBS反复冲洗，保留沃顿胶，剪碎后均匀分散平铺于培养皿中，加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2～3天换液1次，待细胞克隆长至约85％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化并传代。取第3代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化重悬至1.5
×
106/ml，各管分别加入萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR，同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育45min，用PBS洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
[0017]2、细胞转染
[0018]收集第3代hUC
‑
MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化重悬，接种于6孔板中，培养至细胞基本融合为一层时进行转染。使用转染试剂Lipofectamine
TM 2000按照说明书进行操作，将miR
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5p mimics(miR
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5p过表达组)和miR
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5p NC(阴性对照组)分别转染至hUC
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MSCs。转染后培养6h，换完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，收集细胞。另外设置不进行转染操作的空白对照组。
[0019]3、qRT
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PCR检测基因相对表达量
[0020]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，使用抽提试剂盒提取总RNA，取5μg总RNA行反转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应。以U6为内参，miR
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‑
5p基因的相对表达量以2
－
△△
Ct
表示。PCR反应引物如下。
[0021][0022]4、流式检测表面分子标记物
[0023]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，用0.25％胰蛋白酶消化重悬至1.5
×
106/ml，各管分别加入萤光素标记的单克隆抗体CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR，同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育45min，用PBS洗去未结合抗体并重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。
[0024]5、染色法检测细胞的凋亡水平
[0025]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，用0.25％胰酶消化重悬，以每孔1
×
105个接种于预置玻片的24孔板上，每孔1mL，每组设3个重复孔。适应性培养6h后，吸弃培养基，更换为1000μM双氧水处理6h，吸弃双氧水，PBS洗涤3次，取出玻片，根据产品说明书用Annexin
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V和PI染液染色，荧光显微镜下随机选取3个视野观察染色结果。
[0026]6、Western免疫印迹法检测Bax、Bcl
‑
2蛋白相对水平的表达
[0027]收集过表达组、阴性对照组和空白对照组细胞，用0.25％胰酶消化重悬，以每孔1
×
105个接种于24孔板上，每孔1mL，每组设3个重复孔。适应性培养6h后，吸弃培养基，更换为1000μM双氧水处理6h，吸弃双氧水，PBS洗涤3次，收集细胞，蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各组取等量蛋白经SDS凝胶电泳，转移至PVDF膜，加5％脱脂牛奶4℃封闭过夜，分别加入一抗兔抗人Bax、一抗兔抗人Bcl
‑
2，4℃过夜孵育，加入辣根过氧化
物酶标记的二抗，ECL显影，用图像分析系统拍照。以β
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actin内参。
[0028]7、统计学分析
[0029]采用软件SPSS 19.0进行统计学分析处理，计量数据以均数...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高人脐带间充质干细胞中miR
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【专利技术属性】
技术研发人员：于海涛，
申请(专利权)人：南京赛尔健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：