增强NK细胞杀伤力的基因靶标及应用制造技术

本发明专利技术公开了增强NK细胞杀伤力的基因靶标及应用。NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、Granzyme B到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导Granzyme B进入靶细胞，Granzyme B进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测Perforin、Granzyme B、CD107a的表达水平评价NK细胞的杀伤力强弱。本发明专利技术发现，高表达lncRNA

【技术实现步骤摘要】
增强NK细胞杀伤力的基因靶标及应用


[0001]本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及增强NK细胞杀伤力的基因靶标及应用。

技术介绍

[0002]NK细胞又称自然杀伤细胞，是机体固有免疫的组成细胞之一，主要分布于外周血和脾脏。在正常情况下，NK细胞通过识别细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类分子区分“自我”与“非我”以杀伤或诱导凋亡来清除肿瘤细胞或病毒感染细胞。目前，NK细胞已被广泛用于肿瘤的过继免疫治疗中。由于NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5％～15％，因而可以通过体外扩增以满足临床治疗的需求。实验研究已表明，体外扩增的NK细胞在肝癌、胶质母细胞瘤、白血病等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤效应。
[0003]长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度＞200nt但不具备编码蛋白质功能的RNA，占到非编码RNA的80％。lncRNA在细胞生命中发挥重要作用，对细胞各种功能至关重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供增强NK细胞杀伤力的基因靶标及应用。
[0005]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0006]一种体外增强NK细胞杀伤力的方法，提高NK细胞中靶标基因的表达水平，靶标基因为长链非编码RNA。
[0007]优选地，所述长链非编码RNA为lncRNA
‑
AF289591。
[0008]NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、Granzyme B到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导Granzyme B进入靶细胞，Granzyme B进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测Perforin、Granzyme B、CD107a的表达水平评价NK细胞的杀伤力强弱。本专利技术具体实施例说明，高表达lncRNA
‑
AF289591可以有效提高NK细胞的杀伤力。
[0009]有益效果：
[0010]本专利技术发现，高表达lncRNA
‑
AF289591可以有效提高NK细胞的杀伤力。
附图说明
[0011]图1是琼脂糖凝胶电泳测定lncRNA
‑
AF289591表达水平。
[0012]图2是流式法检测Perforin、Granzyme B、CD107a表达水平。
具体实施方式
[0013]一、实验材料
[0014]淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司，品牌为MultiSciences。IL
‑
2购自索莱宝，人AB血清购自上海联硕生物科技有限公司，NK细胞培养基品牌为
CellGro。逆转录试剂盒购自TaKaRa，lncRNA
‑
AF289591mimic、NC
‑
mimic及PCR扩增引物购自上海生工。
[0015]二、实验方法
[0016]1、NK细胞培养和鉴定
[0017]取适量抗凝外周血，加入淋巴细胞分离液，2000rpm离心20min，吸取白膜层，生理盐水洗涤3次，去上清，加入添加有200U/mL IL
‑
2和50mL/L人AB血清的NK细胞培养基(完全培养基)，调整细胞密度为1
×
106/mL，接种于6孔培养板中，于5％CO2、37℃培养箱中培养，根据生长情况及时添加培养基。用PerCP
‑
Cy5.5标记的CD3、FITC标记的CD56与未诱导培养(0d)和培养12d的NK细胞孵育进行流式细胞术检测细胞表型。
[0018]2、分组和转染
[0019]取培养12d的NK细胞，制成细胞密度为2
×
106个/mL的细胞悬液，接种到6孔板，每孔2mL，培养24h后进行转染，分别设置lncRNA
‑
AF289591mimic组、NC
‑
mimic组和空白对照组，转染方式参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。
[0020]3、lncRNA
‑
AF289591含量水平检测(琼脂糖凝胶电泳法)
[0021]收集转染后的NK细胞，洗涤，按照TRIzol试剂盒说明书提取总的RNA并测定RNA浓度。提取完成后，进行RNA浓度测定，保证A260/A280比值大于等于1.8。将获得的RNA采用逆转录试剂盒进行逆转录(TaKaRa)，逆转录所得的cDNA进行PCR扩增，扩增反应完成后，配制1.5％琼脂糖凝胶，取PCR产物各5μL，加入6
×
loading buffer 2μL混合上样，50V电泳60min。利用图像分析系统分析各条带光密度值，拍照。PCR扩增引物序列如下。
[0022]lncRNA
‑
AF289591正向：GTTGCCGTCCCATCAGTTGC(5
’‑3’
)
[0023]lncRNA
‑
AF289591反向：TCACTCAAGGTCACCAGCCA(5
’‑3’
)
[0024]GAPDH正向：CATGGCACCGTCAAGGCTGA(5
’‑3’
)
[0025]GAPDH反向：GGACTCCACGACGTACTCAG(5
’‑3’
)
[0026]4、NK细胞杀伤活性检测(流式法)
[0027]收集转染的NK细胞，PBS洗涤并重悬调整细胞密度为1
×
107/mL，接种于流式管中，每管0.1mL，用PE标记的穿孔素(Perforin)、PE标记的颗粒酶B(Granzyme B)、APC标记的CD107a孵育进行流式细胞术检测。
[0028]5、统计学分析
[0029]使用GraphPad Prism 5软件进行数据统计学分析。数据采用均数
±
标准差表示，两组数据间比较采用配对t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
[0030]三、实验结果
[0031]1、NK细胞培养和鉴定
[0032]流式细胞术检测结果显示，0d细胞CD3
－
CD56
+
阳性率为(10.8
±
3.7)％，培养12d的NK细胞CD3
－
CD56
+
阳性率高达(75.2
±
6.5)％，差异有统计学意义，NK细胞培养成功。
[0033]2、琼脂糖凝胶电泳测定lncRNA
‑
AF289591表达水平
[0034]结果如图1所示，与空白对照组和NC
‑
mimic组相比，lncRNA
‑
AF289591mimic组lncRNA
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外增强NK细胞杀伤力的方法，其特征在于：提高NK细胞中靶标基因的表达水平，所述靶标基因为长链非编码RNA。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海涛，
申请(专利权)人：南京赛尔健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：