一种URAT1人源化小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种URAT1人源化动物模型的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)将背景动物细胞上的URAT1基因替换成人源URAT1基因；以及(2)使该人源URAT1基因在该背景动物细胞中表达并产生人源化URAT1蛋白，同时降低或消除该背景动物细胞内的内源URAT1基因的表达，从而获得该URAT1人源化动物模型。该方法所构建的尿酸特异性转运体URAT1人源化小鼠模型，具有人类的功能性基因，能够用于URAT1靶向药物筛选，或URAT1靶向药物及与其他药物联用的疗效评价，以及药物后续药理及毒理研究。以及药物后续药理及毒理研究。以及药物后续药理及毒理研究。

【技术实现步骤摘要】
一种URAT1人源化小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及动物基因工程和基因遗传修饰
，具体而言，涉及基于一种URAT1人源化动物模型的构建方法及其在医药领域中的运用。

技术介绍

[0002]痛风是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，其临床特点为高尿酸血症及由此而引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏，引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。
[0003]痛风及高尿酸血症作为一种代谢性疾病在我国的发病率逐年递增，是影响人民健康的重大因素。分布在肾近曲小管上皮细胞上尿酸转运蛋白URAT1(human urate transporter 1)和有机阴离子转运蛋白OTA(organic anion transporter)的特异性抑制剂可以减少肾脏对原尿中尿酸的重吸收，从而降低病人血尿酸浓度，是高尿酸血症及痛风药物研发的热门靶点。高尿酸血症除了与痛风有关外，还与多种其它疾病的发生相关，例如与高血压、糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、尿路阻塞和胆石症等疾病密切相关。
[0004]当毛细血管中的血液流经肾小体时，经过肾小球的滤过作用生成原尿，原尿在流经肾小管时其中的大量物质又被选择性的回收到血液，分布于肾小管不同区段的上皮细胞上表达的各种各样的转运蛋白行使着物质回收功能，90％的尿酸重吸收发生在近端肾小管。肾小管上皮细胞具有方向性，位于肾小管上皮细胞基底侧膜或顶端膜的转运蛋白决定了被转运物质的走向，从血液到尿液为分泌过程，从尿液到血液为重吸收过程。URAT1在肾近端小管上皮细胞中(renal proximal tubular)的分布呈方向性，负责从原尿重吸收尿酸到血液。据报道人类URAT1转运蛋白负责50％左右尿酸重吸收过程。根据URAT1特异性转运尿酸的特征，人们开发出针对性的抑制剂来控制尿酸的回收过程，从而调节尿酸在体内的平衡，达到治疗高尿酸血症及痛风的目的。
[0005]靶向人类URAT1的小分子促尿酸排泄药物并不多，其中应用最为广泛的上市药为苯溴马隆(Benzbromarone)，其在体外实验中对hURAT1的抑制率为0.13μM(IC
50
)。但苯溴马隆相关的严重不良反应中肝损害问题比较突出，药物导致了肝功能异常及谷草转氨酶、谷丙转氨酶及碱性磷酸酶升高，所以在临床上使用有所局限。目前开发新的URAT1靶点抑制剂类降尿酸药物的需求非常迫切。
[0006]URAT1抑制剂类降尿酸药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，但由于种属的差异，高尿酸是分类学上高等灵长类动物才出现的特征。另一方面，人类与其它物种URAT1基因的差异导致不同种属的URAT1蛋白对底物尿酸及特异性抑制剂的亲和力差异都很大。啮齿类动物作为应用最广泛的实验小动物模型，已成为药物研发治疗研究中不可或缺的替代模型，但鼠类URAT1蛋白对尿酸的亲和力和人源URAT1蛋白相比相差上千倍，小鼠中URAT1蛋白在血尿酸浓度调节中发挥的作用微不足道，对于URAT1靶点的抑制剂例如苯溴马隆的治疗也几乎没有响应，因此在小鼠上筛选URAT1抑制剂的策略完全不可行。目前靶向人类URAT1药物的动物实验需要新大陆猴或猿类等非人高等灵长类动物才能达到目
的，但由于来源稀少，价格昂贵而限制了使用。所以，没有合适的经济，易得，有效的小动物模型是URAT1靶点药物研究的最大瓶颈，在动物体内建立更接近人类的生理特征的高尿酸血症疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
[0007]现有技术中不存在URAT1人源化小鼠，因此构建URAT1人源化小鼠是对此类促尿酸代谢类药物的筛选，药效评价及药理毒理研究的迫切需求。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的是提供一种URAT1人源化小鼠模型的构建方法，将人源URAT1的编码基因替换小鼠相应的基因，制备得到特异性尿酸转运受体URAT1的人源化小鼠模型，具有人类的功能性基因，可用来筛选并评价以人类的URAT1为靶点的促尿酸代谢药物，解决了啮齿类动物由于与人类之间种属性的差异，无法在小鼠上筛选及评价适用于人类的URAT1抑制剂类药物的问题。
[0009]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种URAT1人源化动物模型的构建方法，该方法包括以下步骤：
[0010](1)将背景动物细胞上的URAT1基因替换成人源URAT1基因；以及
[0011](2)使该人源URAT1基因在该背景动物细胞中表达并产生人源化URAT1蛋白，同时降低或消除该背景动物细胞内的内源URAT1基因的表达，从而获得该URAT1人源化动物模型。
[0012]进一步地，该人源URAT1基因编码的氨基酸序列选自：
[0013]a)该氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0014]b)该氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0015]c)由核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
[0016]d)该氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的序列差异不超过5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
[0017]和/或
[0018]e)该氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0019]进一步地，人源URAT1基因的基因序列选自：
[0020]a)该基因编码权利要求2中的氨基酸序列；
[0021]b)该基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：2所示；
[0022]c)在严格条件下，与SEQ ID NO：2所示的核苷酸杂交的基因序列；
[0023]d)与SEQ ID NO：2所示的核苷酸具有至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
[0024]e)编码氨基酸的基因序列，该氨基酸与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％；
[0025]f)编码氨基酸的基因序列，该氨基酸的序列与SEQ ID NO：1的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基；
[0026]和/或
[0027]g)编码氨基酸的基因序列，该氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
[0028]进一步地，降低或消除该背景动物细胞内的内源URAT1基因的表达是通过替换该背景动物细胞内的内源URAT1基因的外显子1的中间序列而实现的。
[0029]进一步地，该背景动物为啮齿类动物。
[0030]进一步地，该啮齿类动物为小鼠、大鼠或仓鼠。
[0031]进一步地，该啮齿类动物为C57BL品系小鼠。
[0032]进一步地，该小鼠为C57BL/6小鼠。
[0033]进一步地，该细胞为受精本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种URAT1人源化动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将背景动物细胞上的URAT1基因替换成人源URAT1基因；以及(2)使所述人源URAT1基因在所述背景动物细胞中表达并产生人源化URAT1蛋白，同时降低或消除所述背景动物细胞内的内源URAT1基因的表达，从而获得所述URAT1人源化动物模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人源URAT1基因编码的氨基酸序列选自：a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；b)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％；c)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的序列差异不超过5、4、3、2或不超过1个氨基酸；和/或e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人源URAT1基因的基因序列选自：a)所述基因编码权利要求2中的氨基酸序列；b)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：2所示；c)在严格条件下，与SEQ ID NO：2所示的核苷酸杂交的基因序列；d)与SEQ ID NO：2所示的核苷酸具有至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；e)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％；f)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸的序列与SEQ ID NO：1的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基；和/或g)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，降低或消除所述背景动物细胞内的内源URAT1基因的表达是通过替换所述背景动物细胞内的内源URAT1基因的外显子1的中间序列而实现的；优选地，所述背景动物为啮齿类动物；更优选地，所述啮齿类动物为小鼠、大鼠或仓鼠；又优选地，所述啮齿类动物为C57BL品系小鼠；特别优选地，所述小鼠为C57BL/6小鼠；尤其优选地，所述细胞为受精卵细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行
所述URAT1人源化动物模型的建立；优选地，所述基因编辑技术为基因同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术和/或归巢核...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈阿鹏，德格晶，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：