先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用技术

本申请涉及生物技术领域，具体而言，涉及先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用。该构建方法包括：S1、以Lpin1基因为目的基因构建同源重组载体，针对Lpin1基因的第16和18外显子设计gRNA1和gRNA2，所述gRNA1和gRNA2分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；S2、体外转录合成所述gRNA1、gRNA2和Cas9 mRNA；S3、将所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和同源重组载体显微注射至健康的C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；S4、将所述F0代小鼠通过杂交和/或自交的方式获得Lpin1纯合突变的小鼠模型。本申请能够应用于肌无力相关预防、治疗或诊断手段及药物的研发，对相关药物及手段的筛选具有重要生理意义及特异性。理意义及特异性。理意义及特异性。

【技术实现步骤摘要】
先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用。

技术介绍

[0002]肌无力是由肌肉、神经和代谢紊乱导致的神经肌肉类疾病(Goronzy JJ,Weyand CM.Immune aging and autoimmunity.Cell Mol Life Sci.2012；69:1615
‑
23；Lorenzoni PJ,Scola RH,Kay CS,Werneck LC.Congenital myasthenic syndrome:a brief review.Pediatr Neurol.2012；46:141
‑
48.)。肌营养不良、炎症性肌病、神经肌肉疾病、运动神经元疾病和重症肌无力是常见的遗传性肌无力(Hellmann MA,Mosberg
‑
Galili R,Steiner I.Myasthenia gravis in the elderly.J Neurol Sci.2013；325:1
‑
5；Al
‑
Chalabi A,Visscher PM.Motor neuron disease:Common genetic variants and the heritability of ALS.Nat Rev Neurol.2014；10:549
‑
50.)。肌无力疾病的致病机理及相关治疗手段一直是研究热点。
[0003]Lpin1(磷脂酸磷酸酶1,PAP1,EC 3.1.3.4)基因编码，是一个Mg2+依赖的磷脂酸磷酸酶(PAP1)(Harris TE,Huffman TA,Chi A,Shabanowitz J,Hunt DF,Kumar A,et al.Insulin controls subcellular localization and multisite phosphorylation of the phosphatidic acid phosphatase,Lpin 1.J Biol Chem.2007；282:277
‑
86.)，在体内起到控制脂质合成和参与能量代谢的功能(Donkor J,Zhang P,Wong S,O'Loughlin L,Dewald J,Bernard P C,et al.Aconserved serine residue is required for the phosphatidate phosphatase activity but not the transcriptional coactivator functions of Lpin
‑
1 and Lpin
‑
2.J Biol Chem.2009；284:29968
‑
78.)。在细胞质中，Lpin1蛋白作为PAP1酶，将磷脂酸(PA)转化为二酰基甘油(DAG)，合成甘油三酯(TAG)和磷脂；在细胞核中，Lpin1与转录因子互作，发挥转录共激活因子的作用，调控下游基因表达(P
é
terfy M,Harris TE,Fujita N,Reue K.Insulin
‑
stimulated interaction with 14
‑3‑
3 promotes cytoplasmic localization of Lpin
‑
1 in adipocytes.J Biol Chem.2010；285:3857
‑
64.)。
[0004]人类常染色体隐性Lpin1基因突变已被确定为复发、早发横纹肌溶解症(MIM#268200)的主要致病基因，这种疾病的特征是骨骼肌受损导致细胞蛋白(包括肌酸激酶和肌红蛋白)排泄到循环系统。这些研究支持了Lpin1除了在脂质合成和能量代谢中的生化功能外，在周围神经和骨骼肌发育中的重要作用。
[0005]目前关于肌无力的临床研究，很难得到一种便于获得，先天性肌无力模型。基于此，本申请对Lpin1基因突变位点进行研究，提供一种能够应用于肌无力相关治疗手段及药物的研发的小鼠模型，对相关治疗药物及治疗手段的筛选具有重要生理意义及特异性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用，能够应用于肌无力相关预防、治疗或诊断手段及药物的研发，对相关药物及手段的筛选具有重要生理意义及特异性。
[0007]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：第一方面，提供一种先天性肌无力小鼠模型的构建方法，其包括：
[0008]S1、以Lpin1基因为目的基因构建同源重组载体，针对Lpin1基因的第16和18外显子设计gRNA1和gRNA2，所述gRNA1和gRNA2分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
[0009]S2、体外转录合成所述gRNA1、gRNA2和Cas9 mRNA；
[0010]S3、将所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和同源重组载体显微注射至健康的C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；
[0011]S4、将所述F0代小鼠通过杂交和/或自交的方式获得Lpin1纯合突变的小鼠模型。
[0012]进一步地，所述同源重组载体包括2.9kb 5
’
同源臂、2.7kb的PM区域和3.0kb 3
’
同源臂。
[0013]进一步地，S3中还包括：
[0014]利用PCR对所述F0代小鼠进行基因型测序，其中，PCR检测引物序列为SEQ IN NO.3和SEQ IN NO.4。
[0015]进一步地，S4中还包括：
[0016]利用PCR对所述F0代小鼠通过杂交和/或自交的方式得到的后代小鼠进行基因型测序，其中，PCR检测引物序列为SEQ IN NO.5至SEQ IN NO.10。
[0017]进一步地，所述Lpin1纯合突变包括I717L突变位点和R768Q突变位点。
[0018]第二方面，提供根据所述的构建方法得到的小鼠模型或其子代。
[0019]第三方面，提供一种所述的构建方法或所述的小鼠模型或其子代在Lpin1基因或Lpin1蛋白相关领域或者免疫相关领域的应用。
[0020]进一步地，所述应用包括需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在生产和利用动物疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或筛选、验证、评价或研究药物、药效研究，相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
[0021]进一步地，所述应用包括在制备预防、诊断或者治疗人类肌无力及相关并发症的药物的用途。
[0022]进一步地本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种先天性肌无力小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：S1、以Lpin1基因为目的基因构建同源重组载体，针对Lpin1基因的第16和18外显子设计gRNA1和gRNA2，所述gRNA1和gRNA2分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；S2、体外转录合成所述gRNA1、gRNA2和Cas9 mRNA；S3、将所述gRNA1、gRNA2、Cas9 mRNA和同源重组载体显微注射至健康的C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；S4、将所述F0代小鼠通过杂交和/或自交的方式获得Lpin1纯合突变的小鼠模型。2.如权利要求1所述的先天性肌无力小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述同源重组载体包括2.9kb 5
’
同源臂、2.7kb的PM区域和3.0kb 3
’
同源臂。3.如权利要求1所述的先天性肌无力小鼠模型的构建方法，其特征在于，S3中还包括：利用PCR对所述F0代小鼠进行基因型测序，其中，PCR检测引物序列为SEQ IN NO.3和SEQ IN NO.4。4.如权利要求1所述的先天性肌无力小鼠模型的构建方法，其特征在于，S4中还包括：利用PCR对所述F0代小鼠通过杂交和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：田静，卢淑娴，张东伟，
申请(专利权)人：西安英创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：