一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法技术

本发明专利技术公开了一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法，属于牦牛克隆胚胎技术领域。该载体为shRNA的真核表达载体，shRNA靶向CBX3基因，靶序列如SEQ ID NO.1所示：GGTCTTGATCCAGAACGAATA。通过该载体转染牦牛体细胞，获得阳性单克隆；利用阳性单克隆作为供体，进行核移植，构建克隆胚，可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率，为阐明牦牛克隆胚胎重编程机理提供材料基础及理论依据。基础及理论依据。基础及理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法


[0001]本专利技术属于牦牛克隆胚胎
，具体涉及一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法。

技术介绍

[0002]牦牛(Bos grunniens)常年生活在海拔3000
‑
5500m的喜马拉雅山脉和青藏高原地区，属于牛科(Bovidae)牛亚科(Bovinae)。因能适应当地高寒、低氧和强辐射等恶劣生态环境，有“高原之舟”之称，是当地重要的畜种之一，可为当地农牧民提供肉、奶和皮毛等生活必需品，可作为当地重要的运输工具。但牦牛繁殖和生长性能低下、优质种畜少等因素极大的限制了高原畜牧业的发展。
[0003]通过体细胞核移植技术(即克隆技术)，卵母细胞可将体细胞重编程为全能性的胚胎细胞并最终发育成动物个体，使得该技术在优良家畜扩繁、转基因家畜生产、治疗性克隆等方面展示出巨大的应用前景。目前大多家畜已经通过体细胞核移植技术被成功克隆，但至今牦牛这一青藏地区重要的家畜物种尚未被成功克隆。解析牦牛克隆胚胎异常重编程的机制，对提高牦牛克隆胚胎发育率和完善牦牛克隆技术、以及提高牦牛的克隆效率十分重要。
[0004]因此，如何提供一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术公开了一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法，可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，
[0008]所述载体为shRNA的真核表达载体，所述shRNA靶向CBX3基因，靶序列如SEQ ID NO.1所示：GGTCTTGATCCAGAACGAATA。
[0009]优选地，所述shRNA的正义模板链为：
[0010]5'
‑
CACCGGTCTTGATCCAGAACGAATATTCAAGAGATATTCGTTCTGGATCAAGACCTTTTTTG
‑
3'，SEQ ID NO.2；
[0011]所述shRNA的反义模板链为：
[0012]5'
‑
GATCCAAAAAAGGTCTTGATCCAGAACGAATATCTCTTGAATATTCGTTCTGGATCAAGACC
‑
3'，SEQ ID NO.3。
[0013]优选地，所述载体的构建方法为：
[0014]合成编码shRNA的正义模板链与反义模板链，正义模板链与反义模板链退火合成DNA双链，将DNA双链转入pGPU6/GFP/Neo。
[0015]含有上述载体的牦牛体细胞。
[0016]优选地，上述牦牛体细胞为牦牛胎儿成纤维细胞。
[0017]一种提高牦牛克隆胚胎发育率的方法，包括如下步骤：
[0018](1)将上述载体转染牦牛体细胞，获得阳性单克隆；
[0019](2)利用阳性单克隆作为供体，进行核移植，构建克隆胚。
[0020]综上所述，本专利技术载体、细胞和方法可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率，为阐明牦牛克隆胚胎重编程机理提供材料基础及理论依据。
附图说明
[0021]图1所示为牦牛胎儿成纤维细胞原代培养结果；
[0022]A.原代培养第3d；B.原代培养第6d；
[0023]图2所示为shRNA CBX3
‑
yak
‑
500信息；
[0024]图3所示为shRNA CBX3
‑
yak
‑
613信息；
[0025]图4所示为shRNA CBX3
‑
yak
‑
463信息；
[0026]图5所示为shRNA CBX3
‑
yak
‑
433信息；
[0027]图6所示为shRNA CBX3
‑
yak
‑
570信息；
[0028]图7所示为阴性对照shRNA信息；
[0029]图8所示为不同shRNA质粒载体转染入细胞后CBX3 mRNA的相对表达量；
[0030]上标不同表示样品间显著性差异(P<0.05)；
[0031]图9所示为不同shRNA质粒载体转染入细胞后CBX3蛋白表达量；
[0032]图10所示为瞬时转染48h后荧光检测结果(40
×
)；
[0033]A.转染CBX3
‑
463质粒组GFP表达图；B.转染CBX3
‑
463质粒组明场图；
[0034]C.转染shNC质粒组GFP表达图；D.转染shNC质粒组明场图；
[0035]图11所示为G418筛选2
‑
3周后得到的稳定转染带有荧光的阳性单克隆细胞(40
×
)；
[0036]A.阳性单克隆细胞绿色荧光激发效果；B.阳性单克隆细胞明场图；
[0037]图12所示为筛选出的稳定克隆中CBX3 mRNA的相对表达量；
[0038]上标不同表示样品间显著性差异(P<0.05)；
[0039]图13所示为稳定克隆中CBX3蛋白表达水平；
[0040]图14所示为阳性克隆H3K9me3水平；
[0041]图15所示为阳性克隆中SUV39H1、SUV39H2、NSD1、EZH2 mRNA的相对表达量；
具体实施方式
[0042]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0043]实施例所涉及的试剂和材料如下：
[0044]胎牛血清、DMEM高糖培养基、Opti
‑
MEM培养基购自美国Invitrogen公司，G418、EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿购自美国Corning公司，质粒提取
试剂盒购自美国Omega公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，Trizol RNA提取液、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，定量PCR引物由北京擎科生物科技有限公司(西安)合成，BCA蛋白定量试剂盒购自康为世纪公司，shRNA质粒载体均购自上海吉玛公司，CBX3、H3K9me3一抗购自Abcam公司，GAPDH一抗及二抗购自碧云天，其它试剂如无特别说明均购自Sigma公司。
[0045]实施例1
[0046]1.牦牛胎儿成纤维细胞的原代培养
[0047]从青海省西宁市屠宰场取30d
‑
60d胚龄本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，其特征在于，所述载体为shRNA的真核表达载体，所述shRNA靶向CBX3基因，靶序列如SEQ ID NO.1所示：GGTCTTGATCCAGAACGAATA。2.根据权利要求1所述的一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体，其特征在于，所述shRNA的正义模板链为：5'
‑
CACCGGTCTTGATCCAGAACGAATATTCAAGAGATATTCGTTCTGGATCAAGACCTTTTTTG
‑
3'，SEQ ID NO.2；所述shRNA的反义模板链为：5'
‑
GATCCAAAAAAGGTCTTGATCCAGAACGAATATCTCTTGAATATTCGTTCTGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏建民，余彤，张成图，吴英，孟茹，陈永忠，
申请(专利权)人：西宁市动物疫病预防控制中心挂西宁市畜牧兽医站牌子，
类型：发明
国别省市：