一种pProTG质粒、其构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种pProTG质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。所述pProTG质粒的构建方法，包括如下步骤：步骤1：构建puromycinR

【技术实现步骤摘要】
一种pProTG质粒、其构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种pProTG质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建


技术介绍

[0002]嘌呤霉素抗性基因(puroR)能够构建在多种载体上，通过嘌呤霉素(puromycin)筛选转染puroR抗性基因阳性细胞，从而筛选到目的细胞，这项技术广泛应用与医学生物研究领域。不过嘌呤霉素筛选后会出现部分耐药细胞，达不到精确筛选阳性细胞的目的，影响研究结果的准确性。
[0003]增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，简称EGFP)可以通过对细胞进行标记从而追踪细胞，在生物和医学研究中有广泛的应用。不过，该项技术通常需要使用流式细胞仪，很多实验室可能不具备开展这项实验的条件，而且，使用EGFP在活体动物中进行细胞追踪获得的图像背景信号信噪比高，因此定量检测性能差。
[0004]萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,简称FLuc)可以在活体动物中进行细胞追踪，获得的图像背景信号信噪比低，适用于活体动物定量研究。但缺点是没有药物抗性，不能进行流氏分选从而筛选细胞，另外FLuc只有在活细胞内才会产生发光现象，且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
[0005]综上，如何克服puromycin筛选后出现耐药细胞，EGFP需要特定设备和无法在活体动物体内进行精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点？目前尚未有将puroR、EGFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一，是提供一种pProTG质粒的构建方法。
[0007]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种pProTG质粒的构建方法，包括如下步骤：
[0008]步骤1：构建puromycinR
‑
luciferase载体
[0009]步骤1.1：取puromycinR，进行PCR扩增反应，得到puromycinR PCR扩增产物；将puromycinR PCR扩增产物进行酶切，得到puromycinR酶切反应液；将puromycinR酶切反应液再纯化，得到puromycinR酶切产物；
[0010]步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；
[0011]步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的puromycin酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒puromycinR
‑
luciferase；
[0012]步骤1.4：将质粒puromycinR
‑
luciferase转化至大肠杆菌DH5
ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到puromycinR
‑
luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0013]步骤2：构建pProTG质粒
[0014]步骤2.1：取EGFP载体，进行PCR扩增反应，得到EGFP PCR扩增产物；将EGFP PCR扩
增产物进行酶切，得到EGFP酶切反应液；将EGFP酶切反应液再纯化，得到EGFP酶切纯化产物；
[0015]步骤2.2：将步骤1.4得到的puromycinR
‑
luciferase载体进行酶切，得到puromycinR
‑
luciferase酶切反应液；将puromycinR
‑
luciferase酶切反应液再纯化，得到puromycinR
‑
luciferase酶切纯化产物；
[0016]步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的EGFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的puromycinR
‑
luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5
ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到EGFP
‑
puromycinR
‑
luciferase载体，即为pProTG质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0017]步骤3：验证pProTG质粒是否构建成功
[0018]将步骤2构建的pProTG质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTG质粒是否构建成功。
[0019]其中，puromycinR
‑
luciferase载体的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
[0020]atgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgccgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pProTG质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：构建puromycinR
‑
luciferase载体步骤1.1：取puromycinR，进行PCR扩增反应，得到puromycinR PCR扩增产物；将puromycinR PCR扩增产物进行酶切，得到puromycinR酶切反应液；将puromycinR酶切反应液再纯化，得到puromycinR酶切产物；步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反Fluc应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的puromycinR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒puromycinR
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luciferase；步骤1.4：将质粒puromycinR
‑
luciferase转化至大肠杆菌DH5
ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到puromycinR
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luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：构建pProTG质粒步骤2.1：取EGFP载体，进行PCR扩增反应，得到EGFP PCR扩增产物；将EGFP PCR扩增产物进行酶切，得到EGFP酶切反应液；将EGFP酶切反应液再纯化，得到EGFP酶切纯化产物；步骤2.2：将步骤1.4得到的puromycinR
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luciferase载体进行酶切，得到puromycinR
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luciferase酶切反应液；将puromycinR
‑
luciferase酶切反应液再纯化，得到puromycinR
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luciferase酶切纯化产物；步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的EGFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的puromycinR
‑
luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5
ɑ
感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到EGFP
‑
puromycinR
‑
luciferase载体，即为pProTG质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；步骤3：验证pProTG质粒是否构建成功将步骤2构建的pProTG质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTG质粒是否构建成功。2.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.1中，所述puromycinR PCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO
4 2μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA 50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；所述puromycinR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10
×
CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，puromycin PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到puromycinR酶切反应液；所述纯化的具体方法是：(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；(2)puromycinR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；
(4)室温晾干，加入30μl
‑
50μl的ddH2O溶解，即得到酶切puromycinR酶切产物。3.根据权利要求1所述的pProTG质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.2中，所述Fluc载体进行酶切的反应体系为：10
×
CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，NcoⅠ酶1μl，luciferase载体1μg和余量为H2O，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到Fluc载体酶切反应液；所述纯化的具体方法是：(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；(2)Fluc酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min...

【专利技术属性】
技术研发人员：豆晓伟，李青，田园，牟雅君，
申请(专利权)人：贵州医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：