一种利用单碱基编辑器构建长QT疾病干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用单碱基编辑器构建长QT疾病干细胞的方法。本发明专利技术具体地公开了通过对胚胎干细胞KCNH2基因进行单碱基编辑，进而构建长QT综合征疾病干细胞模型的方法，该方法包括选择疾病突变的位点，利用单碱基编辑器在干细胞基因组中引入所述疾病突变，基因编辑检测后进行单细胞克隆培养及鉴定，得到的基因编辑干细胞即为所述疾病细胞模型。利用本发明专利技术所述方法构建的长QT综合征疾病干细胞可以制备KCNH2基因突变导致的长QT综合征疾病的心肌细胞模型，为长QT综合征疾病的治疗提供强有力的工具，具有较大的应用前景。具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用单碱基编辑器构建长QT疾病干细胞的方法


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种利用单碱基编辑器构建长QT疾病干细胞的方法。

技术介绍

[0002]遗传性的长QT综合征(Long QT syndrome，LQTS)是一种心脏结构正常但心肌复极延迟的一组常染色体单基因遗传性心血管疾病，主要表现为心电图校正的QT间期 (QTc)延长，易发尖端扭转型室速导致晕厥甚至发生心源性猝死(sudden cardiacdeath，SCD)。根据突变基因的不同LQTS被分为13个类型，目前共发现1000多个突变位点可以导致该病。最常见的是1型、2型和3型LQTS(LQTS1、LQTS2和LQTS3), 占所有已知基因型LQTS的91％。
[0003]多潜能干细胞(又称多能干细胞，pluripotent stem cells，PSC)是一类具有无限增殖能力、自我更新、复制能力，并能分化成体内几乎全部细胞类型的一种多潜能细胞。多能干细胞通常分为两类：来源于囊胚期胚胎的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES，ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)，后者从成年体细胞被诱导成为多能干细胞。多能干细胞所具有的分化为所有细胞类型的能力，对于研究稀少或难以分离的细胞类型(例如神经元或心肌细胞)来说极具价值。携带疾病突变的干细胞在体外定向分化为目的细胞后，目的细胞会表现出疾病表型，因此可以针对不同疾病建立相应的疾病细胞模型。
[0004]传统构建疾病干细胞的方法是采用同源重组引入疾病突变的方式。然而由于同源重组频率很低，通过同源重组方法实现定点突变的效率也很低，并且操作复杂，实验流程长，会造成基因组损伤，是一个费时费力的工作。单碱基编辑器是在第三代基因编辑CRISPR/Cas9基础上改造而来，通过对Cas9酶进行失活，同时利用碱基修饰酶对目的碱基进行C>T或者A>G的置换。不产生基因组损伤，安全性更高。在编辑效率上可高达80％以上。胞嘧啶编辑器(cytidine base editing，CBE)和腺嘌呤编辑器 (adenine base editing，ABE)是两种单碱基基因编辑工具，其中CBE能够将DNA 的A、T、C和G四种碱基中的靶位点C
·
G向T
·
A转变，而ABE则可将靶位点的A
·
T转变成G
·
C。在人类的遗传疾病中有超过32000种基因变化为单碱基突变，已知的致病单碱基突变中，有48％的突变是G突变成A，有14％的致病突变是A突变成G。因此，利用单碱基编辑器快速、高效地构建具有疾病遗传背景的干细胞，在疾病的基础研究，药物筛选和毒性测试等方面具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何利用单碱基编辑器构建疾病细胞模型(如长QT 综合征疾病细胞模型)。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种构建疾病细胞模型的方法，所述方法包括如下步骤：
[0007]A1)选择疾病突变的位点；
[0008]A2)利用单碱基编辑器在干细胞基因组中引入A1)中所述的疾病突变；
[0009]A3)基因编辑检测；
[0010]A4)单细胞克隆培养及鉴定，得到的基因编辑干细胞即为所述疾病细胞模型。
[0011]进一步地，所述单碱基编辑器可为胞嘧啶编辑器(cytidine base editing，CBE) 或腺嘌呤编辑器(adenine base editing，ABE)。
[0012]进一步地，所述单碱基编辑器具体可为胞嘧啶编辑器(cytidine base editing， CBE)，所述CBE包括CBE sgRNA表达载体。
[0013]所述干细胞可为多能干细胞(Pluripotent Stem Cells)或神经干细胞(neuralstem cell)，但不限于此。
[0014]所述多能干细胞可为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES，ESC)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)或间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSC)。在本专利技术的一个实施例中，所述干细胞为胚胎干细胞。
[0015]上述方法中，所述疾病细胞模型可为长QT综合征(long QT syndrome，LQTS) 疾病细胞模型。所述长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)可为LQTS1、LQTS2 或LQTS3。
[0016]上述方法中，所述疾病突变可为人干细胞的KCNH2基因的编码序列的第1621位碱基由C突变为T(相应的第541位的氨基酸由Arg突变为Cys，R541C)，所述KCNH2 基因的编码序列为SEQ ID No.5。
[0017]所述KCNH2基因位于7号染色体上150944956
‑
150978321位置，序列长度为33366 bp，所述突变位置(c.1621位碱基由C突变为T)是GenBank Accession No.3757 UpdateDate 23
‑
Nov
‑
2021)的第26550位。
[0018]KCNH2基因位于人类7号染色体7q36.1。该基因表达产物是快速整流钾电流I
kr
，与钾离子外流有关。已有的研究表明，KCNH2基因突变可以导致先天性2型长QT综合征(long QT syndrome 2，LQTS2)，该疾病可以引起严重心律失常和猝死。
[0019]上述方法中，所述单碱基编辑器包括表达靶向所述KCNH2基因的sgRNA的载体。
[0020]所述靶向所述KCNH2基因的sgRNA的载体名称为KCNH2 541
‑
CBE，重组载体KCNH2 541
‑
CBE含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段，可以在抗生素的作用下，随着真核细胞的分裂复制而复制，在药物筛选过程中可以极大地富集目的细胞。
[0021]所述重组载体KCNH2 541
‑
CBE是将SEQ ID No.1所示的DNA分子连接到sgRNA表达载体epi
‑
sgRNA
‑
YE1
‑
BE3
‑
BSD(其核苷酸序列是SEQ ID No.4)得到表达靶向所述 KCNH2基因的sgRNA的重组载体。
[0022]上述方法中，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.1。
[0023]上述方法中，A4)中所述鉴定可为在显微镜下将A4)中所述的单细胞克隆分为两部分，其中一部分继续培养，另一部分提取基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建疾病细胞模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A1)选择疾病突变的位点；A2)利用单碱基编辑器在干细胞基因组中引入A1)中所述的疾病突变；A3)基因编辑检测；A4)单细胞克隆培养及鉴定，得到的基因编辑干细胞即为所述疾病细胞模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疾病细胞模型为长QT综合征疾病细胞模型。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病突变为人干细胞的KCNH2基因的编码序列的第1621位碱基由C突变为T，所述KCNH2基因的编码序列为SEQ ID No.5。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述单碱基编辑器包括表达靶向所述KCNH2基因的sgRNA的载体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。6.根据权利要求1
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5中...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴福建，杨晓菲，李富荣，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：