一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，具体涉及动物模型的构建方法领域，所述具体步骤如下：斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物。本发明专利技术能够得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体，利用斑马鱼胚胎透明性与自主溶氧性，使得该突变体能够用于筛选验证不同心血管药物对心血管发育的影响，该斑马鱼动物模型的构建方法对心血管疾病治疗药物的筛选具有重要生理意义及特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法
本专利技术涉及动物模型的构建方法领域，特别涉及一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法。
技术介绍
Heg1(heartofglass)基因是一种跨膜受体，2003年由JohnD.Mably在斑马鱼ENU筛选中鉴定出的一种胚胎隐性致死突变，具有心房心室特异性增大、血流迟滞的心血管疾病表型，Heg1主要调控心脏与血管细胞—细胞间的粘附性，在小鼠中研究显示heg1基因突变会导致内皮屏障减弱，引发败血症、动脉粥样硬化和多发性硬化等心血管疾病，在人类、小鼠和大鼠中均能检测到heg1的同源基因，这就使得heg1突变体中得到的实验数据应用于人类临床提供了可能性，CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas9基因编辑技术是一种精确便捷的基因编辑方式，用于目标基因片段的定点插入、删除、激活，1987年，日本学者首次在Escherichiacoli染色体上发现的了CRISPR，CRISPR/Cas9是一种由RNA引导的核酸内切酶，通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑，CRISPR序列在前导区的调控下，转录出RNA前体经一系列加工为的crRNA，同时转录出反式激活crRNA，与RNaseⅢ—同形成成熟的crRNA，其中crRNA和tracrRNA部分互补配对形成双链RNA，由于其作用是引导Cas9靶向切割DNA，随后gRNA和Cas9形成切割复合体，Cas9蛋白识别目的DNA的PAM位点，gRNA上的序列与基因组DNA序列进行碱基互补配对，随后，复合体上的Cas9蛋白将gRNA所识别的序列进行切割，造成DNA双链的断裂；RuvC则参与另一条链的切割，最终导致双键断裂，在DNA修复过程中，随机插入或缺失一部分碱基，产生移码突变或错误修复，从而完成对敲除靶基因的目的。但是其在实际使用时，如在进行操作的过程中，难以得到得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，以斑马鱼心血管发育调控基因heg1为目的基因，利用CRISPR/Cas9技术，在野生型斑马鱼受精卵中显微注射体外设计合成的heg1特异性gRNA及Cas9蛋白，经过逐代筛选得到heg1基因特异性敲除斑马鱼突变体，观察突变体心血管表型并进行传代保育，本专利技术能够得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体，利用斑马鱼胚胎透明性与自主溶氧性，使得该突变体能够用于筛选验证不同心血管药物对心血管发育的影响，该斑马鱼动物模型的构建方法对心血管疾病治疗药物的筛选具有重要生理意义及特异性，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，所述具体步骤如下：(2)(1)斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物，gRNA体外合成分为如下几步：(1.2)首先以pMD19-T质粒与gRNA序列为模板，PCR扩增DNA序列，再用试剂盒进行gRNA链的合成；(1.2)得到gRNA体外合成模板后可进行gRNA体外合成；(2)受精卵显微注射heg1gRNA及Cas9蛋白，(2.1)注射前准备：配制注射板：用eggwater与琼脂糖粉末配制1.5％凝胶液，趁热将琼脂糖凝胶倒入Dish，利用注射槽模板制作凝胶注射板，冷却凝固；(2.2)制作注射针：利用拉针仪将注射用毛细玻璃管加热拉开，一条毛细玻璃管得到注射用玻璃针，注射时根据需要量裁剪玻璃针细端，注入药品后用于注射；(2.3)配成鱼：注射前一天晚上选择状态良好并且7天内未产卵的成鱼，每个交配盒中放一公一母两条鱼，中间用挡板隔开，注射时拔开挡板，5分钟内即可得到受精卵，每对鱼可产卵300颗；(2.4)显微注射：注射当天早上准备注射试剂，吸取1μLCas9蛋白混合液+1μLgRNA注入玻璃注射针，将注射针固定在注射仪上或直接手持注射针，通过注射以上调节旋钮调节液滴大小，注射量最大不超过1nl，拔掉挡板收集鱼卵，每收集300颗鱼卵进行一轮注射，将收集到的鱼卵放入加入eggwater的培养皿，使用巴斯德管吸取鱼卵倒入注射皿，使用小号毛刷轻轻整理鱼卵排列整齐，正式注射，调整好角度，使液体注射入受精卵一细胞中或上升流位置，折射完成后用小号毛笔将鱼卵轻拨出凹槽，吸入新的eggwater培养皿中，28.5℃恒温培养；(3)测序鉴定gRNA是否工作，大量显微注射并饲养F0代斑马鱼：(3.1)注射完成后待受精卵发育到1.5天时，随机分别吸取15枚注射组胚胎与未注射对照组胚胎，将斑马鱼胚胎移PCR管中，根据样品量加入适量NP40裂解液，使用PCR仪加热裂解胚胎释放DNA，裂解程序为：55℃15小时,95℃20min,16℃forever，程序结束后取出，涡旋振荡仪迅速震荡混匀后掌中宝离心机瞬离十秒钟，组织样品裂解完成，4℃储存，此方法得到的DNA片段长度约1000bp，以此为模板使用靶序列上下游检测引物进行PCR测序；(3.2)将注射后胚胎饲养至成鱼，称F0代，之后将其分别与野生型AB杂交，产生子代胚胎1.5dpf时采用上述方式裂解释放DNA，并用同种检测引物PCR测定基因型，子代测序结果在靶序列附近仍会出现套峰，F0就是需要的突变体；(4)鉴定F0代斑马鱼heg1基因突变情况及突变体保育：此时能够在测序结果中读出此F0碱基突变情况为缺失25个碱基，将F0与野生型杂交，产生子代F1饲养至成鱼，拔取F1鳞片释放DNA，PCR扩增目的条带检测验证碱基突变，选取F1中稳定遗传的杂合子继续进行传代饲养，并用于以后实验；(5)heg1心血管疾病模型表型分析：每个交配盒中放一公一母两条heg1杂合子成鱼，中间用挡板隔开，第二天拔掉挡板收集受精卵，将受精卵放入eggwater于28.5℃恒温培养，在胚胎发育到第2、3、4天时分别进行表型观察，通过对斑马鱼心血管系统形态学观察、心率测量、心血管发育相关基因的表达三方面评价突变体特征，对斑马鱼血管疾病药物筛选模型有效性进行验证；(5.1)心血管形态观察：在凹槽玻片上滴一滴3％甲基纤维素，将斑马鱼胚胎脱膜或剥膜后用吸管吸取斑马鱼，竖直放置待斑马鱼下沉到管口，轻轻挤压稍许将其滴到甲基纤维素表面，用小号毛笔拨动斑马鱼，调整其姿势使适合观察，侧面拍照，使两侧眼、体节重合，尾部和身体处于同一水平面，斑马鱼位置摆好后，在白光镜下可观察到突变体胚胎有明显的心血管畸形，2dpf(受精后2天)突变体心房明显膨大，且能够观察到心脏内明显血液淤积，心脏畸形在接下来的发育中越来越明显，3dpf突变体心房心室膨大，且心脏与背部静脉均可见大量血细胞淤积，4dpf血流淤积与心房心室膨大表型更为严重；(5.2)心率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于，所述具体步骤如下：/n(1)斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物，gRNA体外合成分为如下几步：/n(1.1)首先以pMD19-T质粒与gRNA序列为模板，PCR扩增DNA序列，再用试剂盒进行gRNA链的合成；/n(1.2)得到gRNA体外合成模板后可进行gRNA体外合成；/n(2)受精卵显微注射heg1 gRNA及Cas9蛋白，(2.1)注射前准备：配制注射板：用eggwater与琼脂糖粉末配制1.5％凝胶液，趁热将琼脂糖凝胶倒入Dish，利用注射槽模板制作凝胶注射板，冷却凝固；/n(2.2)制作注射针：利用拉针仪将注射用毛细玻璃管加热拉开，一条毛细玻璃管得到注射用玻璃针，注射时根据需要量裁剪玻璃针细端，注入药品后用于注射；/n(2.3)配成鱼：注射前一天晚上选择状态良好并且7天内未产卵的成鱼，每个交配盒中放一公一母两条鱼，中间用挡板隔开，注射时拔开挡板，5分钟内即可得到受精卵，每对鱼可产卵300颗；/n(2.4)显微注射：注射当天早上准备注射试剂，吸取1μL Cas9蛋白混合液+1μL gRNA注入玻璃注射针，将注射针固定在注射仪上或直接手持注射针，通过注射以上调节旋钮调节液滴大小，注射量最大不超过1nl，拔掉挡板收集鱼卵，每收集300颗鱼卵进行一轮注射，将收集到的鱼卵放入加入egg water的培养皿，使用巴斯德管吸取鱼卵倒入注射皿，使用小号毛刷轻轻整理鱼卵排列整齐，正式注射，调整好角度，使液体注射入受精卵一细胞中或上升流位置，折射完成后用小号毛笔将鱼卵轻拨出凹槽，吸入新的egg water培养皿中，28.5℃恒温培养；/n(3)测序鉴定gRNA是否工作，大量显微注射并饲养F0代斑马鱼：(3.1)注射完成后待受精卵发育到1.5天时，随机分别吸取15枚注射组胚胎与未注射对照组胚胎，将斑马鱼胚胎移PCR管中，根据样品量加入适量NP40裂解液，使用PCR仪加热裂解胚胎释放DNA，裂解程序为：55℃15小时,95℃20min,16℃forever，程序结束后取出，涡旋振荡仪迅速震荡混匀后掌中宝离心机瞬离十秒钟，组织样品裂解完成，4℃储存，此方法得到的DNA片段长度约1000bp，以此为模板使用靶序列上下游检测引物进行PCR测序；/n(3.2)将注射后胚胎饲养至成鱼，称F0代，之后将其分别与野生型AB杂交，产生子代胚胎1.5dpf时采用上述方式裂解释放DNA，并用同种检测引物PCR测定基因型，子代测序结果在靶序列附近仍会出现套峰，F0就是需要的突变体；/n(4)鉴定F0代斑马鱼heg1基因突变情况及突变体保育：此时能够在测序结果中读出此F0碱基突变情况为缺失25个碱基，将F0与野生型杂交，产生子代F1饲养至成鱼，拔取F1鳞片释放DNA，PCR扩增目的条带检测验证碱基突变，选取F1中稳定遗传的杂合子继续进行传代饲养，并用于以后实验；/n(5)heg1心血管疾病模型表型分析：每个交配盒中放一公一母两条heg1杂合子成鱼，中间用挡板隔开，第二天拔掉挡板收集受精卵，将受精卵放入egg water于28.5℃恒温培养，在胚胎发育到第2、3、4天时分别进行表型观察，通过对斑马鱼心血管系统形态学观察、心率测量、心血管发育相关基因的表达三方面评价突变体特征，对斑马鱼血管疾病药物筛选模型有效性进行验证；/n(5.1)心血管形态观察：在凹槽玻片上滴一滴3％甲基纤维素，将斑马鱼胚胎脱膜或剥膜后用吸管吸取斑马鱼，竖直放置待斑马鱼下沉到管口，轻轻挤压稍许将其滴到甲基纤维素表面，用小号毛笔拨动斑马鱼，调整其姿势使适合观察，侧面拍照，使两侧眼、体节重合，尾部和身体处于同一水平面，斑马鱼位置摆好后，在白光镜下可观察到突变体胚胎有明显的心血管畸形，2dpf(受精后2天)突变体心房明显膨大，且能够观察到心脏内明显血液淤积，心脏畸形在接下来的发育中越来越明显，3dpf突变体心房心室膨大，且心脏与背部静脉均可见大量血细胞淤积，4dpf血流淤积与心房心室膨大表型更为严重；/n(5.2)心率测量：在测量斑马鱼心率前，将其放置在室温，适应环境温度15min以上，将斑马鱼胚胎置于凹槽玻片上，滴入1×(0.16mg/ml)MS-222将斑马鱼麻醉，用发圈拨动斑马鱼胚胎，使其呈侧卧状态，使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面，位置摆好后，在体视显微镜下观察，心跳清晰可见，使用手工计数器及计时器记录正常斑马鱼胚胎及突变体胚胎一分钟内心跳数，每条胚胎重复三次，每组重复5个胚胎以上，结果显示心血管疾病模型与野生型相比心率明显较低；/n(5.3)静脉...

【技术特征摘要】
1.一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于，所述具体步骤如下：
(1)斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物，gRNA体外合成分为如下几步：
(1.1)首先以pMD19-T质粒与gRNA序列为模板，PCR扩增DNA序列，再用试剂盒进行gRNA链的合成；
(1.2)得到gRNA体外合成模板后可进行gRNA体外合成；
(2)受精卵显微注射heg1gRNA及Cas9蛋白，(2.1)注射前准备：配制注射板：用eggwater与琼脂糖粉末配制1.5％凝胶液，趁热将琼脂糖凝胶倒入Dish，利用注射槽模板制作凝胶注射板，冷却凝固；
(2.2)制作注射针：利用拉针仪将注射用毛细玻璃管加热拉开，一条毛细玻璃管得到注射用玻璃针，注射时根据需要量裁剪玻璃针细端，注入药品后用于注射；
(2.3)配成鱼：注射前一天晚上选择状态良好并且7天内未产卵的成鱼，每个交配盒中放一公一母两条鱼，中间用挡板隔开，注射时拔开挡板，5分钟内即可得到受精卵，每对鱼可产卵300颗；
(2.4)显微注射：注射当天早上准备注射试剂，吸取1μLCas9蛋白混合液+1μLgRNA注入玻璃注射针，将注射针固定在注射仪上或直接手持注射针，通过注射以上调节旋钮调节液滴大小，注射量最大不超过1nl，拔掉挡板收集鱼卵，每收集300颗鱼卵进行一轮注射，将收集到的鱼卵放入加入eggwater的培养皿，使用巴斯德管吸取鱼卵倒入注射皿，使用小号毛刷轻轻整理鱼卵排列整齐，正式注射，调整好角度，使液体注射入受精卵一细胞中或上升流位置，折射完成后用小号毛笔将鱼卵轻拨出凹槽，吸入新的eggwater培养皿中，28.5℃恒温培养；
(3)测序鉴定gRNA是否工作，大量显微注射并饲养F0代斑马鱼：(3.1)注射完成后待受精卵发育到1.5天时，随机分别吸取15枚注射组胚胎与未注射对照组胚胎，将斑马鱼胚胎移PCR管中，根据样品量加入适量NP40裂解液，使用PCR仪加热裂解胚胎释放DNA，裂解程序为：55℃15小时,95℃20min,16℃forever，程序结束后取出，涡旋振荡仪迅速震荡混匀后掌中宝离心机瞬离十秒钟，组织样品裂解完成，4℃储存，此方法得到的DNA片段长度约1000bp，以此为模板使用靶序列上下游检测引物进行PCR测序；
(3.2)将注射后胚胎饲养至成鱼，称F0代，之后将其分别与野生型AB杂交，产生子代胚胎1.5dpf时采用上述方式裂解释放DNA，并用同种检测引物PCR测定基因型，子代测序结果在靶序列附近仍会出现套峰，F0就是需要的突变体；
(4)鉴定F0代斑马鱼heg1基因突变情况及突变体保育：此时能够在测序结果中读出此F0碱基突变情况为缺失25个碱基，将F0与野生型杂交，产生子代F1饲养至成鱼，拔取F1鳞片释放DNA，PCR扩增目的条带检测验证碱基突变，选取F1中稳定遗传的杂合子继续进行传代饲养，并用于以后实验；
(5)heg1心血管疾病模型表型分析：每个交配盒中放一公一母两条heg1杂合子成鱼，中间用挡板隔开，第二天拔掉挡板收集受精卵，将受精卵放入eggwater于28.5℃恒温培养，在胚胎发育到第2、3、4天时分别进行表型观察，通过对斑马鱼心血管系统形态学观察、心率测量、心血管发育相关基因的表达三方面评价突变体特征，对斑马鱼血管疾病药物筛选模型有效性进行验证；
(5.1)心血管形态观察：在凹槽玻片上滴一滴3％甲基纤维素，将斑马鱼胚胎脱膜或剥膜后用吸管吸取斑马鱼，竖直放置待斑马鱼下沉到管口，轻轻挤压稍许将其滴到甲基纤维素表面，用小号毛笔拨动斑马鱼，调整其姿势使适合观察，侧面拍照，使两侧眼、体节重合，尾部和身体处于同一水平面，斑马鱼位置摆好后，在白光镜下可观察到突变体胚胎有明显的心血管畸形，2dpf(受精后...

【专利技术属性】
技术研发人员：田静，卢淑娴，张东伟，
申请(专利权)人：西安英创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61