一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法。包括以下步骤：（1）将目的基因重组载体与含细胞周期调控相关基因p18和/或调控细胞生长的基因aFGF的共转基因重组载体共转染CHO细胞；所述基因p18的序列如SEQ ID NO:1所示；所述基因aFGF的序列如SEQ ID NO:2所示；（2）将共转基因重组载体和目的基因重组载体共转染到CHO细胞中后，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；（3）将瞬时和稳定转染CHO细胞株进行悬浮无血清培养，得到目的蛋白。本发明专利技术方法可以显著提高目的基因在CHO细胞中的表达水平，实现目的蛋白在CHO细胞的瞬时和稳定高水平表达。在CHO细胞的瞬时和稳定高水平表达。在CHO细胞的瞬时和稳定高水平表达。

【技术实现步骤摘要】
一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法。

技术介绍

[0002]随着基因工程技术的发展，重组蛋白在基础研究、生物技术应用以及临床治疗方面的需求持续增长。哺乳动物细胞是重组药物蛋白的首选表达细胞，其中中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）具有适合工业生产的大规模悬浮生长、受病毒感染的风险较小、产物翻译后修饰功能，并产生与人类天然蛋白质相似的高质量蛋白以及对重组基因的高效扩增和表达能力，已成为工业生产中使用最广泛的哺乳动物细胞系。
[0003]近年来，围绕提高CHO细胞重组蛋白表达，研究人员做了大量的工作。如通过培养基的优化、表达载体的优化、细胞系的改造等方法使CHO细胞生产力得到了一定的提高。如申请公布号为CN107828738A的中国专利技术专利申请公开了一种DNA甲基转移酶缺陷型CHO细胞系及其制备方法及应用，其通过敲除CHO细胞DNA甲基转移酶Dnmt3a基因，实现提高重组蛋白的表达水平、克服重组蛋白表达不稳定的问题。申请公布号为CN109486859A的中国专利技术专利申请公开了人工合成的polyA、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及应用，其通过更换表达载体的polyA序列提高CHO细胞中重组蛋白质的产量。申请公布号为CN110894487A的中国专利技术专利公开了一种无血清无蛋白CHO细胞培养基及其制备方法、应用，其通过优化培养基成分，促进CHO细胞生长，提高目的蛋白的产量。
[0004]除了培养基、表达载体和细胞系的优化改造，重组蛋白的生产还受到蛋白质翻译、蛋白质折叠和分泌过程的影响。通过过表达、下调或敲除特定基因来改善或调节细胞凋亡、细胞周期、蛋白的折叠及分泌等过程，可以提高重组蛋白的表达。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法。该方法将含调控细胞周期和/或促进细胞生长基因的共转基因重组载体和目的基因重组载体进行共转染，以调控目的基因的表达，进而提高 CHO细胞中重组蛋白的表达量。
[0006]为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：（1）将目的基因重组载体和含细胞周期调控相关基因p18序列和调控细胞生长的基因aFGF序列的共转基因重组载体进行共转染CHO细胞；其中，p18是一种细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子，能够抑制周期蛋白依赖激酶，将细胞阻滞在G1/S期，通过调控细胞周期影响重组蛋白的表达。p18基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]促进细胞增殖的酸性成纤维素生长因子（aFGF），通过促进细胞增殖影响重组蛋白的表达水平。aFGF基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]共转基因重组载体和目的基因重组载体需要按一定比例进行转染，本专利技术通过筛选发现，目的基因重组载体和共转基因重组载体的最佳共转比例为10:1。
[0009]（2）将共转基因重组载体和目的基因重组载体共转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；本专利技术的CHO细胞表达系统即是利用共转含细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p18和/或酸性成纤维细胞生长因子aFGF的共转基因重组载体，促进目的基因的高效表达，进而提高CHO细胞中重组蛋白的表达量。
[0010]（3）将瞬时和稳定转染CHO细胞株进行悬浮无血清培养，得到目的蛋白。
[0011]在一些具体实施方式中，所述CHO细胞为CHO
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K1、CHO
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S、DG44中的任意一种。使用CHO
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K1、CHO
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S、DG44细胞系制备得到的CHO细胞表达系统均能够达到相应的技术效果，实现目的蛋白的高水平瞬时和稳定表达。
[0012]在一些具体实施方式中，所述转染的方法为磷酸钙法、电转法、脂质体转染或者PEI转染。
[0013]在一些具体实施方式中，步骤（1）中所述目的基因重组载体为含EGFP报告基因、阿达木抗体基因或玻连蛋白（Vitronectin, VTN）基因的真核表达载体。
[0014]在一些具体实施方式中，步骤（1）中所述共转基因重组载体是在pIRES
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neo载体基础上构建的含p18、aFGF、p18+aFGF或aFGF+p18的真核表达载体，如图1、2、3所示。关于抗性基因，在本专利技术中，将共转表达载体的抗性基因更换为杀稻瘟菌素抗性，使目的基因重组载体和共转基因重组载体的筛选标记不同。
[0015]当共转基因重组载体中含有p18和aFGF两个基因时，p18基因可以位于aFGF基因的上游或者下游，作为优选方案，p18基因位于aFGF基因的上游时，目的蛋白表达水平较高。
[0016]利用上述制备方法可以制备得到CHO细胞表达系统，然后将稳定转染CHO细胞株进行悬浮无血清培养，实现目的蛋白在CHO细胞中的高产量稳定表达。
[0017]本专利技术的有益效果为：本专利技术方法构建的CHO细胞表达系统可以显著提高目的基因在CHO细胞中的表达水平，实现目的蛋白在CHO细胞的瞬时和稳定高水平表达。具体的，本专利技术将共转基因重组载体和目的基因重组载体共转染到CHO细胞中，以提高目的基因的表达水平，特别是在目的基因重组载体和共转基因重组载体比例为10:1、共转基因重组载体中p18基因位于aFGF基因的上游时时，目的基因的表达水平较高。
附图说明
[0018]图1为共转基因表达载体pIRES
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p18/aFGF图；图2为共转基因表达载体pIRES
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p18
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aFGF图；图3为共转基因表达载体pIRES
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aFGF
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p18图；图4为不同共转比例（目的基因重组质粒:共转基因重组质粒）转染CHO细胞EGFP瞬时表达水平图；图5为不同共转比例（目的基因重组质粒:共转基因重组质粒）转染CHO细胞EGFP稳定表达水平图；图6为共转CHO细胞阿达木瞬时和稳定表达水平图；图7为共转CHO细胞VTN瞬时和稳定表达水平图。
具体实施方式
[0019]下面通过具体实施方式对本专利技术进行更加详细的说明，以便于对本专利技术技术方案的理解，但并不用于对本专利技术保护范围的限制。
[0020]以下实施例中，所用CHO细胞为CHO
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K1，购自中国科学院上海细胞库。
[0021]目的基因重组质粒所用的真核基因表达载体是在pIRES
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neo载体基础上构建的含EGFP报告基因、阿达木或玻连蛋白基因的真核表达载体，为新霉素抗性。
[0022]共转基因重组载体是在pIRES
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neo载体基础上构建的，将其抗性基因更换为杀稻瘟菌素抗性。
[0023]实施例中所述重组质粒即为重组载体。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将目的基因重组载体与含细胞周期调控相关基因p18和/或调控细胞生长的基因aFGF的共转基因重组载体共转染CHO细胞；所述基因p18的序列如SEQ ID NO:1所示；所述基因aFGF的序列如SEQ ID NO:2所示；（2）将共转基因重组载体和目的基因重组载体共转染到CHO细胞中后，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；（3）将瞬时和稳定转染CHO细胞株进行悬浮无血清培养，得到目的蛋白。2.根据权利要求1所述的一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO
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K1、CHO
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S、DG44中的任意一种。3.根据权利要求1所述的一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述转染的方法为磷酸钙法、电转法、脂质体转染或者PEI转染...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小引，王天云，张玺，易丹丹，林艳，赵春澎，贾岩龙，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：