一种逆向跨多级神经示踪方法技术

本发明专利技术公开了一种逆向跨多级神经示踪方法，是构建能够表达狂犬病病毒G蛋白的转基因动物，再用失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株感染转基因动物，利用转基因动物被感染的细胞为失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株提供G蛋白，恢复感染传播活性，实现逆向跨多级神经示踪目的。该方法对神经元的标记效率和效果都更加优秀，相较于PRV神经元毒性更小、基因组长度更短、而且能感染灵长类动物，因此更有利于后续对神经元形态即功能的研究，更符合后续脑连接组研究的需求。组研究的需求。组研究的需求。

【技术实现步骤摘要】
一种逆向跨多级神经示踪方法


[0001]本专利技术涉及采用病毒进行神经示踪研究
，具体涉及一种利用G蛋白缺陷型狂犬病毒进行逆向跨多级神经示踪的方法。

技术介绍

[0002]狂犬病(Rabies)是全世界已知最致命的神经性病毒性疾病之一。绝大部分病例的产生与欧洲、亚洲和非洲的狗咬伤以及美洲的蝙蝠咬伤离不开关系。不同亚种的狂犬病毒(Rabies Virus，以下简称为RV)导致的狂犬病表型有所差异，大致分为狂躁型狂犬病与瘫痪型狂犬病，被咬伤后根据RV亚种不同以及伤口大小，发病率也不尽相同，相同的是其发病后接近百分之一百的死亡率，全球每年有数以万计的人因狂犬病死亡。
[0003]RV归类于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。病毒外壳呈弹状，有包膜包裹，核衣壳螺旋对称，内含负义单链RNA，编码5种病毒蛋白，分别为G蛋白(Glycoprotein，糖蛋白，以下简称为G蛋白)，N蛋白(Nucleoprotein，核蛋白)，P蛋白(Phosphoprotein，磷蛋白)，M蛋白(Matrix protein，基质蛋白)和L蛋白(Large protein，大蛋白，本质是RNA导向的RNA聚合酶)。其中G蛋白与RV的感染与传播息息相关，在失去G蛋白的情况下，RV无法形成感染性病毒颗粒，也无法感染与传播，从另一个意义上来说，G蛋白也定义了RV的感染与传播特性。不同亚种的RV携带的G蛋白的序列与特性不尽相同，在神经系统中的感染与传播效率也有所不同。根据RV的致死与否，RV目前的亚株又被分为不致死的疫苗株以及致死的街毒株。相对来说，街毒株G蛋白的感染与传播效率强于疫苗株，以实验室常用的街毒株以及疫苗株来说，作为街毒株的CVS株G蛋白的感染与传播效率就要显著强于作为疫苗株的SAD株G蛋白。
[0004]目前RV因为其嗜神经以及失去G蛋白后没有感染与传播能力的特性，被广泛应用于神经系统的环路标记上。神经系统的环路标记根据其电信号的传播方向分为两大类，一个是顺着电信号方向传播的顺向神经示踪标记，另一个是逆着电信号方向传播的逆向神经示踪标记。根据其跨神经元级数的标记模式，又被分为点对点精准标记的跨单级神经示踪标记，以及接连不断感染，并标记所有感染神经元的跨多级神经示踪标记。可以说RV是目前最为成功的逆向跨单级神经示踪病毒工具之一。其做法是将RV基因组上的G蛋白基因敲除之后，原位添加了一个GFP(绿色荧光蛋白，以下简称GFP)基因用于表达GFP，从而对它感染上的神经元进行绿色荧光标记，人为控制这个被感染的神经元A为RV提供G蛋白，就可以让RV完成生活周期跨一级出去，利用神经元之间的突触连接进行感染，感染所有和这个神经元A有关系的神经元B并进行标记，而神经元B不能为RV提供G蛋白，这样RV的感染和传播就会到此为止，一轮标记流程下来就只会标记神经元A和所有与神经元A相关的神经元B。这样人们就可以通过荧光显微镜来观察被绿色荧光标记的神经元，从而对大脑以及神经元之间的链接进行研究。
[0005]之所以要敲除掉G蛋白基因，一是由于携带G蛋白基因的RV可以完成它完整的病毒感染生活周期，这样就和感染狂犬病毒没有任何区别，有相当程度的生物安全危险性。二是
由于实验目标的需要，即对脑内神经环路的研究需要相对精准的点对点关系，如果一个病毒可以在神经元之间不断地感染复制，那么当我们观察时，根本无法判断这些后续被RV感染和标记的神经元究竟是不是和所要研究的目标脑区有着直接联系，这种跨多级的标记方式并不是脑内研究的主流需求，所以RV作为神经示踪工具使用时，基因组里基本都是没有G蛋白的。
[0006]但是，用去除G蛋白基因的RV进行神经示踪也造成了一个空白，在脑内研究中跨多级的标记方式不是主流并不代表这个示踪方式不被人需要，研究外周神经环路与中枢神经系统的关系时，采用点对点也就是跨单级标记方式的工具根本无法从外周回到脑内，所以必须采用跨多级的标记方式进行标记。而RV如上所述，由于其特性，如果能够跨多级标记，那就和感染RV没有多少区别，有相当程度的生物安全危险性。所以目前这项任务主要由标记效果与标记效率比RV相对差很多的病毒工具，假狂犬病毒，也就是Pseudorabies virus(以下简称PRV)示踪工具来担当。让PRV基因组携带GFP基因或者其他颜色的荧光蛋白基因来对每一个感染的神经元进行标记，因为PRV不感染灵长类动物，所以生物安全性上相对RV来说安全不少，也是现在最主流的，用于逆向跨多级神经示踪的病毒工具。
[0007]PRV示踪工具作为逆向示踪病毒工具与RV示踪工具相比，在常用的小鼠模型动物上的标记效率(指感染神经元的数量)以及标记效果(指神经元标记亮度)均较弱，并且由于更大的神经元毒性，被标记的神经元往往呈现出不正常的形态，并在非常短的标记周期中失去生物活性，不利于进行下一步的研究。而且作为它优点之一的生物安全性是因为它不感染灵长类动物，这又带来另外一个问题：后续脑连接组的研究需要利用神经示踪工具来研究更接近人类的灵长类模式动物比如猴子，那么毫无疑问PRV示踪工具根本无法胜任——因为它感染不了猴子——并影响后续的脑连接组计划。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种逆向跨多级神经示踪方法，以解决RV标记所带来的生物安全性问题，以及PRV标记效率和标记效果弱、不能感染灵长类动物的问题。
[0009]本专利技术技术方案详述如下：
[0010]一种逆向跨多级神经示踪方法，是构建能够表达狂犬病病毒G蛋白的转基因动物，再用失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株感染转基因动物，利用转基因动物被感染的细胞为失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株提供G蛋白，恢复感染传播活性，实现逆向跨多级神经示踪目的。
[0011]可选或优选的，上述逆向跨多级神经示踪方法中，所述转基因动物构建方法如下：构建含有外源G蛋白编码基因的打靶载体，通过同源重组的方式插入到实验动物胚胎干细胞的Rosa26位点两外显子之间，胚胎干细胞发育获得外源全身性表达G蛋白的转基因动物。
[0012]可选或优选的，上述逆向跨多级神经示踪方法中，所述打靶载体为Rosa26
‑
tdTomato
‑
G
‑
TVA
‑
vector，基因组包括5
’
同源臂、启动子CAG、LSL表达盒、tdTomato序列、G蛋白编码基因序列、IRES序列、TVA序列、WPRE序列、PA序列、FRT序列、Neo抗性基因、3
’
同源臂、pGK启动子、DTA序列、polyA signal、CoLE1质粒复制起点、AmpR抗性基因、F1单链DNA复制起点。
[0013]上述打靶载体中，各基因序列的功能说明如下：
[0014]5’
同源臂和3
’
同源臂是用于同源重组到ROSA26位点的两端序列。
[0015]启动子CAG，是高效无差别表达的启动子。
[0016]LSL表达框：Loxp
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，构建能够表达狂犬病病毒G蛋白的转基因动物，再用失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株感染转基因动物，利用转基因动物被感染的细胞为失去G蛋白的缺陷型狂犬病病毒株提供G蛋白，恢复感染传播活性，实现逆向跨多级神经示踪目的。2.根据权利要求1所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述转基因动物构建方法如下：构建含有外源G蛋白编码基因的打靶载体，通过同源重组的方式插入到实验动物胚胎干细胞的Rosa26位点两外显子之间，胚胎干细胞发育获得外源全身性表达G蛋白的转基因动物。3.根据权利要求2所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述打靶载体为Rosa26
‑
tdTomato
‑
G
‑
TVA
‑
vector，基因组包括5
’
同源臂、启动子CAG、LSL表达盒、tdTomato序列、G蛋白编码基因序列、IRES序列、TVA序列、WPRE序列、PA序列、FRT序列、Neo抗性基因、3
’
同源臂、pGK启动子、DTA序列、polyA signal、CoLE1质粒复制起点、AmpR抗性基因、F1单链DNA复制起点。4.根据权利要求3所述的逆向跨多级神经示踪方法，其特征在于，所述打靶载体添加有酶切位点，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫焱，宋一舸，李浩，张冰，李澜芳，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：