一种快速、持续获取VASA阳性类生殖细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种VASA阳性类生殖细胞的制备方法及其应用，具体的，经加入生长因子TGF

【技术实现步骤摘要】
一种快速、持续获取VASA阳性类生殖细胞的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养及生物医药领域。具体的，涉及一种快速、持续获取VASA阳性类生殖细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]生殖细胞，也称为配子，是多细胞生物遗传物质代际传递的载体。自然界物种的延续和繁殖主要依赖于生殖细胞。不孕不育已成为一种常见病，全世界有15%的夫妇受到影响。多能干细胞是一种具有自我更新能力的多能细胞，理论上具有发育成包括生殖细胞在内的所有类型细胞的能力。多能干细胞体外分化为生殖细胞为治疗不孕不育症提供了一种可行的方法。 2003年以来，相关研究组陆续报道了各种体外诱导多能干细胞为生殖细胞的研究。
[0003]现有技术1（Embryonic stem cells can form germ cells in vitro）公开了使用BMP4和BMP8a诱导小鼠胚胎干细胞分化，并获得了少量VASA阳性的生殖细胞。
[0004]现有技术2（Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells）公开了通过bFGF和激活素A短期刺激获得外胚层样细胞（EpiLC）。随后加入BMP4、BMP8a、LIF、SCF和EGF，对这些外胚层样细胞进行大规模转化进入原始生殖细胞。
[0005]现有技术3（Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell
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Derived Germ Cells In Vitro）首次实现了小鼠雄性生殖细胞诱导系统的完整体外重建，在该方法应用激活素A和BMPs 促进生殖细胞增殖，仅仅是在现有技术2的基础上提供一种在体外进行的方法。
[0006]现有技术4（SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate）和5（Robust In Vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells）公开了与小鼠类似，当使用含有bFGF、TGF
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β、1% KSR的培养基和含有BMP2/4、LIF、SCF和EGF的培养基分两阶段培养人胚胎干细胞时，大量人原始生殖细胞也可以获得。然而，以这种方式获得的原始生殖细胞也处于早期阶段。在这些细胞中，无法检测到晚期生殖细胞标记基因的表达，如 DAZL和VASA。从hESC生成更成熟的原始生殖细胞仍然是一项重大挑战，尤其是采用与临床应用兼容的策略。
[0007]但是，上述方法均存在过程繁琐、耗时较长，以及无法持续产生的不足，难以满足临床需要。

技术实现思路

[0008]Essential 8培养基是一种成分明确，无动物来源的干细胞培养基，专为人类多能干细胞的生长和扩增而配制。在本专利技术中，我们发现在Essential 8培养基培养的条件下，会不断出现一组VASA阳性细胞。这些VASA阳性细胞可以通过生殖报告系统VASA
‑
GFP 报告基因进行富集，表达生殖细胞的显著特征。进一步发现，这些VASA阳性细胞只需要在E6+
TGF
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β的条件下即可产生。因此，本专利技术提供了一套持续、快速获取VASA阳性类生殖细胞的方法。具体的：本专利技术第一方面，提供一种生长因子在诱导多能干细胞分化为类生殖细胞中的应用，所述的生长因子包括转化生长因子
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β（Transforming growth factor beta，TGF
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β/TGFb）。
[0009]优选的，所述的生长因子还包括碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，FGF2/bFGF）、骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein 2、4、7、8a，BMP2、4、7、8a)、从胶质细胞源性神经营养因子(Glialcellline
‑
derivedneurotrophicfactor，GDNF)、表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）和干细胞因子(Stem cell factor，SCF)中的一种或多种。
[0010]在一个具体的实施方式中，所述生长因子仅包含TGF
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β。
[0011]优选的，所述的TGF
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β浓度为1
‑
3ng/ml。
[0012]优选的，所述的多能干细胞是IPS细胞或ES细胞。
[0013]优选的，所述的多能干细胞中包含VASA报告系统，进一步优选的，所述的VASA报告系统包含VASA启动子和报告基因，更优选的，所述的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）、人生长激素基因（hGH）、分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）、红色荧光蛋白基因（RFP）、绿色荧光蛋白基因（GFP）、增强绿色荧光蛋白基因（eGFP）、β
‑
半乳糖苷酶基因（β
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Gal）或萤火虫荧光素酶基因。更进一步优选的，所述的报告基因为eGFP或GFP。
[0014]优选的，所述的类生殖细胞具有原始生殖细胞、分化的生殖细胞，例如精子或卵子细胞的性能。
[0015]优选的，所述的原始生殖细胞为早期的原始生殖细胞或成熟的原始生殖细胞，例如VASA阳性类生殖细胞，进一步优选的，所述的类生殖细胞同时表达VASA及eGFP/GFP蛋白。
[0016]优选的，所述的VASA阳性类生殖细胞相对于不表达VASA报告系统的细胞，其成熟的原始生殖细胞标记物表达量增高，所述的标记物包括VASA，更优选的，所述标记物还包括BLIMP1、C
‑
KIT、DAZL、DND1、TFAP2C、KLF4、LIN28a、SOX2、NANOS3和/或STELLA中的一种或者多种，进一步优选的，所述标记物BLIMP1、C
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KIT、DAZL、LIN28a、SOX2、STELLA显著性增加。
[0017]更优选的，所述的VASA阳性类生殖细胞相对于不表达VASA报告系统的细胞，其以下标记物表达量降低，所述的标记物包括NANOG和/或OCT4，进一步优选的，所述标记物OCT4显著性降低。
[0018]本专利技术第二方面，提供一种培养基，所述培养基包括基础培养基和生长因子，所述生长因子包括TGF
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β。
[0019]优选的，所述TGF
‑
β浓度为1
‑
3ng/ml。
[0020]优选的，所述的生长因子还包括碱性成纤维细胞生长因子（FGF2，bFGF）、骨形态发生蛋白(BMP2、4、7、8a)、从胶质细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生长因子在诱导多能干细胞分化为类生殖细胞中的应用，其特征在于，所述的生长因子包括TGF
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β。2.一种培养基在诱导多能干细胞分化为类生殖细胞中的应用，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和生长因子，所述的生长因子包括TGF
‑
β。3.如权利要求1
‑
2任一所述的应用，其特征在于，所述的生长因子还包括bFGF、BMP2、BMP 4、BMP 7、BMP 8a、GDNF、EGF、LIF和SCF中的一种或多种。4.如权利要求1
‑
2任一所述的应用，其特征在于，所述的类生殖细胞为VASA阳性类生殖细胞。5.一种VASA阳性类生殖细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括用培养基对多能干细胞进行培养，所述培养基包括基础培养基和生长因子，所述生长因子包括TGF
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β。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪家葵，梁健霖，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
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