一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法技术

本发明专利技术提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，包括向牛胚胎干细胞体外培养体系中添加终浓度为10-40μg/mL的抗肿瘤药物naringenin进行维持培养。通过多能性检测，结果表明naringenin可显著增强牛胚胎干细胞多能因子的表达，同时naringenin可促进牛胚胎干细胞系原有的多种表观形态趋向均一。本发明专利技术提供的应用抗肿瘤药物naringenin体外培养牛胚胎干细胞多能性的方法，为转基因克隆牛的研究与生产提供了可用于基因转染和体外长期培养筛选的牛胚胎干细胞，并可用于进一步地牛胚胎干细胞相关研究。干细胞相关研究。

【技术实现步骤摘要】
一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法。

技术介绍

[0002]胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是来源于植入前胚胎内细胞团(Inner cell mass，ICM)，保持未分化状态并能够自我更新的多能性细胞，具有分化为机体所有细胞的潜力，可用于早期胚胎发育的研究。
[0003]目前牛胚胎干细胞建系和维持的方法存在一定的问题，如获得的牛胚胎干细胞多能性不理想、表型不均一、可应用性较差等。提高牛胚胎干细胞多能性，使其具有更广泛的可应用能力，具有重要生物学意义。
[0004]Naringenin(柚皮素)，化学名称为4,5,7-三羟基黄酮，分子式为C
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O5，是一种黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类水果、番茄、樱桃、葡萄柚等植物中。柚皮素已被报道具有许多药理特性，包括抗肿瘤、抗癌、抗炎症、心脏保护、抗血脂、抗肥胖、抗糖尿病和抗纤维化等。同时也具有广泛的生物学活性，例如自由基清除活性、抗氧化、抗增殖等。目前尚未见将naringenin应用于牛胚胎干细胞体外培养研究报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供抗肿瘤药物naringenin在牛胚胎干细胞体外培养中的应用，其中，化合物naringenin的结构如式1)所示：
[0007][0008]第二方面，本专利技术提供一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，包括：向牛胚胎干细胞的体外培养液中添加终浓度为10-40μg/mL的naringenin(优选10μg/mL、40μg/mL)进行牛胚胎干细胞的体外培养和传代。
[0009]牛胚胎干细胞对naringenin具有浓度依赖性，naringenin浓度为10μg/mL时，可达到最佳长期培养效果，牛胚胎干细胞多能性标记基因有明显上调。naringenin浓度为40μg/mL时，可达到最佳短期培养效果，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较10μg/mL时高。naringenin浓度为60μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有较强毒性，牛胚胎干细胞增殖受到明显抑制，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较40μg/mL时低，但较对照组(未用naringenin培养的牛胚胎干细胞)明显升高。naringenin浓度为80μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有明显毒性。
[0010]本专利技术使用的提高牛胚胎干细胞多能性的方法，体外培养液为含有10-40μg/mL naringenin、20ng/mL rhFGF2(重组人成纤维细胞生长因子-2)、13.28mg/mL low fatty acid BSA(低脂肪酸牛血清蛋白)、2.5μΜIWR-1的TeSR-E6(TeSR
TM-E6)培养基。
[0011]IWR-1为Wnt通路抑制剂，分子式为C
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N3O3，结构式如下：
[0012][0013]前述的方法，体外培养牛胚胎干细胞所采用的培养条件为：37℃，5％CO2，每天更换一次培养液。培养过程中需与丝裂霉素处理C57小鼠胎儿成纤维细胞获得的饲养层细胞共培养。
[0014]本专利技术中，细胞传代方法包括：提前准备铺有饲养层细胞(新鲜配制)的孔板；用TripLE Select消化牛胚胎干细胞3min，用DMEM/F12基础培养液终止消化，传代比例为1:4。
[0015]饲养层细胞的制备方法包括：解冻原代C57小鼠胎儿成纤维细胞，在37℃，5％CO2条件下进行扩增培养至P3代，待细胞密度达80％-90％，用含有12μg/mL丝裂霉素的小鼠胎儿成纤维细胞培养液处理2.5h后冻存。
[0016]其中，小鼠胎儿成纤维细胞培养液为：含10％FBS(胎牛血清)和1％Penicillin-Streptomycin的DMEM培养液。
[0017]饲养层细胞的使用方法包括：使用前一天解冻处理好的饲养层细胞过夜贴壁恢复活力后，与牛胚胎干细胞共培养。
[0018]本专利技术提供的一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，还包括对体外培养和传代的牛胚胎干细胞进行冷冻保存的步骤。
[0019]冻存方法包括：用mFreSR干细胞冻存液进行程序化冷冻保存。
[0020]本专利技术中，牛ESCs是从牛的体外受精胚胎中获得的牛胚胎干细胞。
[0021]利用本专利技术提高牛胚胎干细胞多能性的方法获得的牛胚胎干细胞可在体外长期稳定传代，且细胞克隆形态均一。通过多种干细胞多能性手段检测证明牛胚胎干细胞多能性确实有所提高。
[0022]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0023]本专利技术是体外培养获得牛胚胎干细胞后，在体外培养牛胚胎干细胞的培养体系中加入抗肿瘤药物naringenin可增加牛胚胎干细胞多能性，具体有效使用浓度为10-40μg/mL。添加naringenin体外培养获得的牛胚胎干细胞可进行胚胎干细胞传代、冻存和解冻等常规操作。本专利技术要求每天更换培养液一次，传代比例为1:4。传代过程中对添加naringenin体外培养获得的牛胚胎干细胞进行细胞多能性鉴定。通过多项多能性检测，最终得出结论，naringenin可显著增加牛胚胎干细胞多能因子的表达，同时naringenin可促进牛胚胎干细胞系原有的多种表观形态趋向均一。本专利技术阐述的应用抗肿瘤药物naringenin体外培养牛胚胎干细胞的方法，为转基因克隆牛的研究与生产提供了可用于基因转染和体外长期培养筛选的牛胚胎干细胞，并可用于进一步的牛胚胎干细胞相关研究。
[0024]本专利技术利用naringenin提高牛胚胎干细胞多能性。牛胚胎干细胞对naringenin的
浓度依赖性，具体表现为，naringenin浓度为10μg/mL时，可达到最佳长期培养效果，naringenin浓度为40μg/mL时，可达到最佳短期培养效果，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较10μg/mL时高，naringenin浓度为60μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有较强毒性，牛胚胎干细胞增殖受到明显抑制，牛胚胎干细胞多能性标记基因上调程度较40μg/mL时低，但较对照组(未用naringenin培养的牛胚胎干细胞)明显升高，naringenin浓度为80μg/mL时，对牛胚胎干细胞具有明显毒性，说明naringenin对牛胚胎干细胞的增殖和多能性均有明显影响。
[0025]naringenin处理后，牛胚胎干细胞多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG的表达明显上调，牛胚胎干细胞的初始态多能性标记基因(例如KLF4、DNMT3L、REX-1、TBX3等)的表达均有显著上调，牛胚胎干细胞的始发态多能性标记基因(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)的表达有小幅度上调，说明naringenin可使牛胚胎干细胞多能性向初本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.化合物naringenin在牛胚胎干细胞体外培养中的应用，其中，化合物naringenin的结构如式1)所示：2.一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法，其特征在于，包括：向牛胚胎干细胞的体外培养液中添加终浓度为10-40μg/mL的naringenin进行牛胚胎干细胞的体外培养和传代；其中，naringenin的结构如式1)所示。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，体外培养液为含有10-40μg/mL naringenin、20ng/mL rhFGF2、13.28mg/mL low fatty acid BSA和2.5μΜ IWR-1的TeSR-E6培养基。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，体外培养牛胚胎干细胞所采用的培养条件为：37℃，5％ CO2，每天更换一次培养液。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以丝裂霉素处理过的C57小鼠胎儿成纤维细胞作为饲...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪玲，李琛，韩雪洁，相金柱，岳永莉，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：