用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用技术方案

本发明专利技术公开用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用，该方法包括：选择至少一个微卫星位点作为靶标；设计针对靶标的探针组，该探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，侧翼探针覆盖至少一个微卫星位点序列的侧翼序列；利用探针组捕获目标序列。本发明专利技术的侧翼探针与常规野生型探针相比不仅能够有效避开GC异常的区域，而且能够有效弥补丢失的有效测序读段，进而显著提高微卫星位点的覆盖度。此外，本发明专利技术独特的探针设计能够大大提高靶点的捕获效率，提高探针的特异性和GC均一性。因此，本发明专利技术的探针组、系统、检测方法在癌症相关微卫星检测中具有较高的检测价值以及临床价值和广阔的应用前景。检测价值以及临床价值和广阔的应用前景。检测价值以及临床价值和广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体地涉及用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]微卫星不稳定性(Microsatellite Instability, MSI)，是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星(Microsatellite, MS)序列长度改变的现象。MSI在结直肠癌，在子宫内膜癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌等实体瘤中均有发生。
[0003]临床研究证实，MSI与结直肠癌的预后有着密切的关系。MSI
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H结直肠癌患者相比MSS患者具有显著的生存优势，临床表现较差，但预后更好。研究证实，针对Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者，MSI
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H患者的总生存期及无病生存期明显延长。美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)发布的结直肠癌指南，建议MSI检测应在所有结直肠癌史的病人中进行。
[0004]目前检测癌细胞中的MSI时，既可以通过检测MMR基因缺失来确定是否发生MSI，如依赖于免疫组化技术的蛋白水平检测，也可以直接检测MSI的序列变化。具体包括：(一) 免疫组化方法(Immunohistochemistry, IHC)常见的方法为采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表达。此方法检测MSI相对较简单，成本较低。但存在一些问题，如使用抗体的不一致、病理医生的阅片标准不一致等。
[0005](二) 分子水平的检测1. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术目前主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳的方法。通过PCR方法检测特异的微卫星重复序列扩增判定MSI状态，比较肿瘤患者的标本组织与正常组织的位点突变情况。大量的实验证实，MMR免疫组化检测结果与MS的PCR检测结果有高度关联性，灵敏度92%，特异性可达100%。
[0006]该方法目前是检测MSI的方法学“金标准”，但操作过程复杂，花费较高，且在结果判断中会碰到以下问题，如荧光的过强或过少、非特异性峰、不显著的峰大小改变，杂合性缺失等。
[0007]2. 新一代测序方法(Next Generation Sequencing, NGS)NGS又称为第二代测序技术，是一种高通量测序技术，能一次性对几十万到几百万条基因分子进行序列测定。目前NGS方法已经成为检测MSI的新工具，其最大优势是可以实现多位点高通量检测。实验证明，NGS方法较MSI
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PCR方法具有更高的敏感性。
[0008]目前仍亟需一种基于第二代测序技术实现微卫星不稳定位点的方便、高效、准确检测的探针组、检测方法及系统。
[0009]
技术介绍
中的信息仅仅在于说明本专利技术的总体背景，不应视为承认或以任何形式
暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0010]为解决现有技术中的技术问题，本专利技术人通过深入研究，设计了针对多达138个MSI位点的特异性探针，惊奇地发现与常规野生型探针相比，设计特异性侧翼探针不仅能够有效避开GC异常的区域，而且能够有效弥补孤儿探针的边缘效应所丢失的有效测序读段，进而显著提高MSI这种GC异常区域的覆盖度(如图3所示)。此外，本专利技术独特的探针设计能够大大提高靶点的捕获效率，提高探针的特异性和GC均一性。因此，本专利技术的探针组、检测方法在癌症相关微卫星检测中具有较高的检测价值以及临床价值和广阔的应用前景。具体地，本专利技术包括以下内容。
[0011]本专利技术的第一方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其包括以下步骤：(1) 选择至少一个微卫星位点作为靶标；(2) 设计针对靶标的探针组，其中，所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列；(3) 利用所述探针组捕获目标序列。
[0012]根据本专利技术所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，所述侧翼序列包括微卫星位点序列的5
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端序列，且与微卫星位点序列的距离为0
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20bp；和/或所述侧翼序列包括微卫星位点序列的3
’
端序列，且与微卫星位点序列的距离为0
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20bp。
[0013]根据本专利技术所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，所述探针组进一步包括野生型探针，所述野生型探针覆盖对应微卫星位点的序列且与之完全匹配。
[0014]根据本专利技术所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，所述探针组进一步包括优化探针，其为当候选侧翼探针在基因组上比对的位置超过20时，在所述候选侧翼探针的基础上向微卫星位点移动从而使探针覆盖微卫星位点中小于10个碱基而形成的探针。
[0015]根据本专利技术所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，针对各微卫星位点的探针由一条野生型探针和两条侧翼探针组成，且两条侧翼探针分别覆盖对应微卫星位点的5
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端和3
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端之一。
[0016]根据本专利技术所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，进一步包括利用引物对目标序列进行扩增富集的步骤。
[0017]根据本专利技术所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，进一步包括对目标序列进行二代测序的步骤。
[0018]本专利技术的第二方面，提供用于二代测序微卫星不稳定位点检测的系统，其包括：获取测序数据单元，所述测序数据含有与第一方面所述的微卫星位点对应的测序读段；数据处理单元，所述数据处理单元通过数据处理得到用于微卫星不稳定性多态性分析的有效数据量；微卫星不稳定性多态性分析单元，基于所述有效数据量，确定重复单元的改变，并
输出微卫星不稳定性状态；根据本专利技术所述的系统，优选地，所述重复单元为单碱基重复单元，所述重复单元数为10
‑
30。
[0019]根据本专利技术所述的系统，优选地，所述改变包括但不限于重复单元的插入和/或缺失。
[0020]本专利技术的第三方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组，所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列。
[0021]根据本专利技术所述的探针组，优选地，进一步包括针对至少一个微卫星位点的野生型探针，所述野生型探针覆盖至少一个微卫星位点序列且与之完全匹配。
[0022]根据本专利技术所述的探针组，优选地，所述至少一个微卫星位点选自由表2所示的微卫星位点组成的组。
[0023]本专利技术的第四方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的试剂盒，其包括根据第三方面所述的探针组和说明书，其中，所述说明书包括如何使用所述探针组进行微卫星不稳定位点的检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1) 选择至少一个微卫星位点作为靶标；(2) 设计针对靶标的探针组，其中，所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列；(3) 利用所述探针组捕获目标序列。2.根据权利要求1所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其特征在于，所述侧翼序列包括微卫星位点序列的5
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端序列，且与所述微卫星位点序列的距离为0
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20 bp；和/或所述侧翼序列包括微卫星位点序列的3
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端序列，且与所述微卫星位点序列的距离为0
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20 bp。3.根据权利要求1所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其特征在于，所述探针组进一步包括野生型探针，所述野生型探针覆盖对应微卫星位点的序列且与之完全匹配。4.根据权利要求3所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其特征在于，针对各微卫星位点的探针由一条野生型探针和两条侧翼探针组成，且两条侧翼探针分别覆盖对应微卫星位点的5
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端和3
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端之一。5.根据权利要求1所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其特征在于，进一步包括优化探针，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙雪，赵颖，王伟伟，杨洲，张吉娜，田埂，
申请(专利权)人：元码基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：