用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法技术

本发明专利技术公开一种用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法。本发明专利技术首先使用随机引物结合到经高碱条件变性的DNA链上，并使用具有3

【技术实现步骤摘要】
用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法


[0001]本专利技术涉及测序领域，具体地涉及一种用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，本专利技术的方法特别适用于利用痕量核酸扩增及靶向捕获技术对来源于但不限于激光显微切割的FFPE样本如单细胞样本进行测序。

技术介绍

[0002]组织样本的保存多采用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的方法。该样本类型是临床以及科研中非常重要且非常丰富的一种样本类型，对临床及科研的发展具有很大的价值。临床及科研中，由于肿瘤组织的异质性和肿瘤细胞占比差异或是其他需求，需要对FFPE切片中的一小部分特定细胞团进行检测。特定细胞团的获取可用激光显微切割(LCM)或其他方法。对特定细胞团在DNA层面的检测，可检测或需要检测的靶标越来越多。近几年高通量测序技术不断成熟，应用高通量测序技术进行肿瘤DNA的检测越来越广泛。
[0003]然而，由于特定细胞团样本量极低，有时常低于100个细胞，按每个细胞大约6.6皮克DNA来计算，100个细胞的DNA含量常不足1纳克，即特定细胞团的DNA含量经常为皮克级别；同时，FFPE样本在制作及保存的过程中会有降解及核酸断裂的情况，对FFPE样本进行DNA的高通量测序所需要的起始DNA的量也会较常规样本要高，常规需要200纳克或更多DNA，特定细胞团皮克级别的DNA含量很难用常规的检测方法进行检测。针对皮克级DNA含量的样本，单细胞全基因组扩增(WGA)是一个可以放大样本量的方法，然而常规的单细胞全基因组扩增常见的起始样本为细胞或微量的DNA样本，少量研究有用到新鲜冷冻组织样本，目前没有关于对FFPE样本细胞团样本经全基因组扩增后的下游检测的报道。对来源于但不限于激光显微切割的FFPE切片上的特定细胞团样本存在进行高通量测序检测DNA分子特征的需求。
[0004]
技术介绍
中的信息仅仅在于说明本专利技术的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中样本DNA含量极低，特别是皮克级含量，常规检测方法难以实现高通量测序检测的问题，本专利技术提供一种用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法。具体地，本专利技术包括以下内容。
[0006]本专利技术提供一种用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其包括以下步骤：
[0007](1)使用裂解液将样本裂解，终止反应后，使随机引物结合到变性的DNA单链，用具有3
’‑5’
外切酶校正功能的链置换聚合酶在等温条件下进行扩增，由此得到含有20kb以上，优选50kb以上，如60kb、80kb、100kb以上等支叉状长片段的预扩增产物；
[0008](2)向所述预扩增产物中加入无水醇清洗，特别是无水乙醇，离心后加入醇水混合溶剂(如乙醇)重悬，离心后去上清，沉淀干燥得到长片段支叉状DNA；和
[0009](3)将长片段DNA打断至200
‑
400bp，如250bp、300bp、350bp等，经末端修复和加A后
连接接头，纯化后进行杂交捕获构建测序文库。
[0010]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其中，步骤(1)中所述样本为激光显微切割的FFPE样本。
[0011]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其中，步骤(1)中所述随机引物为六聚体引物。
[0012]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其特征在于，所述样本中包含单细胞，或样本中核酸含量为皮克级别。
[0013]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其中，步骤(1)中等温条件下的温度为25
‑
50℃，如30、35、40℃，反应时间为5
‑
15小时，如6小时、8小时、10小时等。
[0014]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其中，步骤(2)中醇水混合溶剂中醇和水的体积比为60
‑
80:40
‑
20，如65:35、70:30、75:25等。
[0015]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其中，步骤(3)的纯化包括向反应体系中加入磁珠，醇洗和回溶步骤。
[0016]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其中，其为基于单细胞全基因组扩增的测序方法。
[0017]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其进一步包括对预扩增产物进行质检的步骤。
[0018]本专利技术首先使用随机引物结合到经高碱条件变性的DNA链上，并使用具有3
’‑5’
外切酶校正功能的链置换聚合酶(如Phi29)，在等温条件下进行扩增，可获得长度达100kb的DNA长片段，产量可达微克或几十微克，且对基因组有较好的覆盖，能够满足多种下游实验需求的扩增产物。此外，本专利技术的方法能够对FFPE进行单细胞测序，而传统的单细胞测序的样本为冷冻样本或新鲜样本。本专利技术根据激光显微切割的FFPE切片细胞团样本的表面积、体积和吸附力等特点，对裂解液体系和体积以及后续实验体系和成分进行了相应的调整，以适配FFPE切片细胞团样本，使得这种特殊的样本类型也能够使用常规基于单细胞全基因组扩增的试剂进行DNA扩增，并满足后续实验需求。
[0019]本专利技术发现采用特定的乙醇纯化对预扩增产物进行纯化，比磁珠纯化法有更高的核酸回收率(60
‑
80％)，从而能够更大程度的保留核酸模板，有利于下游的核酸检测。乙醇纯化能够大大提升回收率的原因不清楚，可能在于本专利技术的预扩增产物具有特殊的支叉结构，对于此类支叉结构的DNA用传统的方法如磁珠纯化方法回收效率较低。
[0020]本专利技术的方法中，经过质控的预扩增产物，通过采用靶向捕获的方法来进一步提升目标区域检测的成功率和稳定性。通过该方法获得的样本的基因测序数据符合常规的质控标准，可以实现对痕量FFPE样本进行基因变异分析和解读，如基因组片段或基因的拷贝数变化，样本的单倍型分析、点突变、插入缺失的检测等。通过对同样样本全外显子组捕获数据和靶向捕获数据进行比较分析，基因靶向捕获测序较外显子测序，可以更显著提高目标区域的覆盖度和突变检出下限，激光显微切割结合预扩增靶向捕获技术可以成为更适合用于微量FFPE样本基因检测的方法学。
附图说明
[0021]图1本专利技术方法的示例性流程图；
[0022]图2为样本1的扩增产物条带分布图；
[0023]图3为样本2的扩增产物条带分布图；
[0024]图4为样本3的扩增产物条带分布图；
[0025]图5为阳性对照的扩增产物条带分布图；
[0026]图6为阴性对照的扩增产物条带分布图；
[0027]图7为样本1的测序文库的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用裂解液将样本裂解，终止反应后，使随机引物结合到变性的DNA单链，用具有3
’‑5’
外切酶校正功能的链置换聚合酶在等温条件下进行扩增，由此得到含有20kb以上支叉状长片段的预扩增产物；(2)向所述预扩增产物中加入无水醇清洗，离心后加入醇水混合溶剂重悬，离心后去上清，沉淀干燥得到长片段支叉状DNA；和(3)将长片段DNA打断至200
‑
400bp，经末端修复和加A后连接接头，纯化后进行杂交捕获构建测序文库。2.根据权利要求1所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其特征在于，步骤(1)中所述样本为激光显微切割的FFPE样本。3.根据权利要求1所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其特征在于，步骤(1)中所述随机引物为六聚体引物。4.根据权利要求1所述的用于对样本中的核酸进行高通量测序的方法，其特征在于，所述样本中包含单细胞，或样本中核酸含量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利利，王伟伟，倪守峰，刘星宇，王晨，田埂，
申请(专利权)人：元码基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：