用于完整端粒扩增子测序的组合物制造技术

本发明专利技术公开用于完整端粒扩增子测序的组合物

【技术实现步骤摘要】
用于完整端粒扩增子测序的组合物、预文库及其构建方法


[0001]本专利技术涉及基因测序，具体地涉及用于完整端粒扩增子测序的组合物
、
预文库及其构建方法
。

技术介绍

[0002]端粒是位于真核生物线性染色体末端，由端粒
DNA
重复序列和相关蛋白质构成的复合物
。
由于线性染色体的
DNA
复制机制，使得细胞的每次分裂导致端粒缩短
。
端粒的变化与多种疾病密切相关，如癌症
、
早衰综合征等
。
因此尽可能准确的对端粒进行检测可以提供与疾病相关的重要信息
。
[0003]由于端粒序列较长，且其中含有大量6碱基简单重复序列，人端粒序列的重复单元为
TTAGGG(forward strand)/CCCTAA(reverse strand)
，总长度约
2kb
‑
20kb
，使用二代测序
(NGS
，代表平台为
Illumina、MGI)
无法测通，只能使用针对长片段测序方法
(
比如纳米孔测序技术
)
对长度在
5kb
以上的片段进行序列测定
。
[0004]在上述测序中的常规建库方法依然存在无法区分完整端粒末端和基因组断裂端点的问题，由于基因组在提取过程中会造成大量断裂端点，此外还会存在一定量的不完整端粒末端，数量远远多于完整的端粒末端，常规的端粒建库方式无法有效地对其进行区分，将会导致这一类的建库方法无法对完整或长片段端粒序列进行有效富集，长片段端粒序列占比极低，短片段偏好严重，导致文库有效数据占比低下，会造成测序数据量的极大浪费，同时也极易导致纳米孔测序失败，很难测到准确的端粒序列和真实的长度分布状态，严重影响后续分析和解读
。
[0005]此外，由于三代测序等长片段测序平台的芯片孔数限制，常规建库方法直接建库很难测到端粒序列，很难通过加大数据量来弥补，因此测序时多在带有接头的文库基础上，使用设计的端粒特异性引物和文库接头上的另一条引物进行
PCR
扩增，进行端粒序列的富集，但因为提取时产生的断点数量较多，还有大量的不完整端粒末端，造成富集效率较低，测到的端粒序列很少，无法有效进行端粒序列测定
。
另外，存在多个染色体末端序列未确定，也存在染色体的末端序列不能找到理想的引物序列，因此该方法也有局限，只能测定部分染色体的端粒序列，且其比例异常
。
[0006]目前仍需要一种用于完整端粒扩增子测序的组合物
、
预文库及其构建方法
。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在的至少部分技术问题，专利技术人设计了一系列端粒特异性接头，为端粒添加接头时，能够区分和富集完整端粒末端，并避免非完整末端被建库
。
同时，本专利技术在端粒序列附近的基因组序列上设计了针对端粒扩增使用的端粒特异性
PCR
引物
。
具体地，本专利技术包括以下内容
。
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种用于完整端粒扩增子测序的组合物，其包括用于扩增端粒相邻区域的引物和端粒特异性温控锚定接头，所述端粒特异性温控锚定接头包括引
物结合区
、
单碱基重复区和端粒特异性锚定区，所述端粒特异性锚定区能够与端粒3’
端悬臂的至少部分特异性结合
。
[0009]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述用于扩增端粒相邻区域的引物包括
SEQ ID No.1
‑
12
所示序列中的至少一种外侧引物和
SEQ ID No.13
‑
24
所示序列中的至少一种内侧引物序列
。
[0010]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区两部分的
Tm
值
(
本文有时也称为
T1)
比所述单碱基重复区的
Tm
值
(
本文有时也称为
T2)
高至少
5℃
以上
。
[0011]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述端粒特异性锚定区的长度为4‑
10nt
，优选
6nt。
[0012]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述端粒特异性锚定区的序列能够与重复单元为
TTAGGG
的序列特异性结合
。
[0013]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述端粒特异性锚定区的序列选自
CCCTAA、ACCCTA、AACCCT、CCTAAC、TAACCC
和
CTAACC
中的至少一种
。
[0014]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述单碱基重复区的
Tm
值
(
即
T2)
为
37℃
以下
。
[0015]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述单碱基重复区的长度为5‑
20nt。
[0016]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述引物结合区对应的引物序列的
Tm(
即
T3)
值在
55℃
‑
70℃
之间
。
[0017]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述引物为巢式
PCR
引物
。
[0018]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其中，所述引物结合区包含至少1条引物的结合区
。
[0019]本专利技术的第二方面，提供一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，其包含第一方面所述的组合物
。
[0020]在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，其进一步包括用于扩增端粒相邻区域的引物
。
[0021]本专利技术的第三方面，提供一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建方法，其包括以下步骤：
(1) 制备末端添加单碱基重复序列的样本片段；
(2) 使所述样本片段与本专利技术所述的端粒特异性温控锚定接头混合，在第一温度下预变性，然后在第二温度下杂交，其中，所述末端添加的单碱基重复序列与单碱基重复区的序列互补；
(3) 在第三温本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，包括用于扩增端粒相邻区域的引物和端粒特异性温控锚定接头，所述端粒特异性温控锚定接头包括引物结合区
、
单碱基重复区和端粒特异性锚定区，所述端粒特异性锚定区能够与端粒3’
端悬臂的至少部分特异性结合
。2. 根据权利要求1所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述用于扩增端粒相邻区域的引物包括
SEQ ID No.1
‑
12
所示序列中的至少一种外侧引物和
SEQ ID No.13
‑
24
所示序列中的至少一种内侧引物序列
。3.
根据权利要求1所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述单碱基重复区与所述端粒特异性锚定区两部分的
Tm
值比所述单碱基重复区的
Tm
值高至少
5℃。4.
根据权利要求3所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述单碱基重复区的
Tm
值为
37℃
以下
。5.
根据权利要求1所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述引物结合区对应的引物序列的
Tm
值在
55℃
‑
70℃
之间
。6.
根据权利要求5所述的用于完整端粒扩增子测序的组合物，其特征在于，所述引物结合区包含至少1条引物的结合区
。7.
一种用于完整端粒扩增子测序的预文库构建试剂或试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求1‑6任一项所述的组合物
。8.
一种用于完整端粒扩增子测序的预...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪鑫，倪守峰，王伟伟，田埂，
申请(专利权)人：元码基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：