产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了产L

【技术实现步骤摘要】
产L
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苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及产L
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苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L
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苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L
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苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。
[0003]随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第
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56至
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18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L
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threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。CN105543156A通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ
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0213
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3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。CN106635945A通过在大肠杆菌中强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ
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0215
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2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种新型的产L
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苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
[0005]本专利技术构思如下：本专利技术以大肠杆菌MHZ
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0215
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2为出发菌株(参见ZL201611250306.8)，根据大肠杆菌中L
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苏氨酸的代谢路径及出发菌株MHZ
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0215
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2的遗传背景，在其基因组上进行相关改造，强化菌株的生物素合成。具体包括生物素合成路径中关键基因的强化和过表达，例如，将生物素合成操纵子bioABFCD的表达加强，包括用强启动子替换原有启动子，或者增强RBS的强度以及在基因组上增加bioABFCD的拷贝数；解除BirA(DNA结合转录阻遏物/生物素
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[乙酰
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CoA
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羧化酶]连接酶)对生物素合成操纵子bioABFCD的转录阻遏；另外，将上述两种改造方式组合，协同增加丙酮酸羧化酶(pyc基因编码)的辅因子生物素的供应，以进一步提高菌株生产苏氨酸的能力。
[0006]此外，谷氨酸棒状杆菌中与苏氨酸合成路径相关的酶(主要为丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶)的表达被强
化，从而提高谷氨酸棒状杆菌的氨基酸生产能力，特别是L
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苏氨酸的生产能力；在此基础上，进行生物素合成birA基因的表达强化，以进一步提高苏氨酸的生产能力。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供产L
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苏氨酸的基因工程菌，所述产L
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苏氨酸的基因工程菌是采用基因工程手段，通过强化菌株的生物素合成路径得到工程菌。
[0008]所述菌株为具有苏氨酸生产能力的菌株，优选埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)中的细菌，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
[0009]所述基因工程菌可选自A～D中的任一种：
[0010]A、通过增强菌株中编码NCBI参考序列NC_000913.3(807968..812947)的基因bioABFCD，获得的基因增强菌株；
[0011]B、通过改变菌株中编码NCBI参考序列NC_000913.3(4173082..4174047)的基因birA，获得的基因改变菌株；
[0012]C、通过增强菌株中编码NCBI参考序列NC_000913.3(807968..812947)的基因bioABFCD，同时弱化大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3(4173082..4174047)的基因birA，获得的基因工程菌；
[0013]D、通过增强谷氨酸棒状杆菌中的birA(NCBI编号：cg0814、Cgl0709、NCgl067)的表达强化。
[0014]本专利技术中，bioABFCD是一个操纵子，5个基因连在一起，Gene ID分别为945376、945370、945384、945388和945387。Sequence：NC_000913.3(807968..812947,complement)。
[0015]增强的途径可选自以下1)～3)中的至少一种：
[0016]1)通过将强启动子与生物素合成基因可操作地连接而增强；
[0017]2)通过增加染色体上生物素合成基因的拷贝数而增强；
[0018]3)通过增加染色体上生物素合成基因启动子的RBS序列的强度而增强；
[0019]所述弱化包括敲除或降低所述基因的表达。弱化的方法可选自诱变、定点突变、同源重组等中的至少一种。
[0020]考虑到基因表达强化及弱化无法通过举例穷尽，本专利技术仅做示例性列举，实际操作时技术人员可根据具体情况做适应性调整，因此本专利技术所指强化及弱化包括但不限于实施例中公开的内容。
[0021]所述强启动子可选自Ptac、Plac、Ptrp、Ptrc、Psod等。
[0022]定点突变的方法可选自S1～S3中的任一种：
[0023]S1、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；
[0024]S2、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产L
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苏氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述产L
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苏氨酸的基因工程菌是采用基因工程手段，通过强化菌株的生物素合成路径得到工程菌；所述菌株为具有苏氨酸生产能力的菌株，优选埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)中的细菌，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，增强的途径选自以下1)～3)中的至少一种：1)通过将强启动子与生物素合成基因可操作地连接而增强；2)通过增加染色体上生物素合成基因的拷贝数而增强；3)通过增加染色体上生物素合成基因启动子的RBS序列的强度而增强；所述弱化包括敲除或降低所述基因的表达；弱化的方法选自诱变、定点突变、同源重组中的至少一种。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子选自Ptac、Plac、Ptrp、Ptrc、Psod。4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，定点突变的方法选自S1～S3中的任一种：S1、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；S2、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；S3、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S，且第58位氨基酸由Y突变为F。5.根据权利要求1
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4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为保藏编号为CGMCC No.13403的大肠杆菌MHZ
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0215
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2。6.根据权利要求1
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4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为模式菌株经过天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶中的至少一个表达强化的菌株。7.产L
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苏氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法选自以下方案I～VII，或任选的组合：方案I、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接；方案II、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数；方案III、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD启动子的RBS序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧敏，尹春筱，康培，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：