用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用制造技术

本发明专利技术涉及植物检疫技术领域，公开了用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，所述引物组一包括正向引物B.d

【技术实现步骤摘要】
用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用


[0001]本专利技术涉及植物检疫
，具体涉及用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用。

技术介绍

[0002]猕猴桃原产于我国，因其果实营养丰富，富含维生素C和多种矿质元素及氨基酸等而广受人们喜爱。猕猴桃产业发展迅速，其栽培面积由1978年的零起步，到2017年达到250,000公顷，超过世界其他所有猕猴桃生产国种植面积总和。猕猴桃属于呼吸跃变型果实，有明显的生理后熟过程，采后极易变软腐烂，不耐贮藏。猕猴桃软腐病是发生在果实贮藏期的一种最为常见的真菌性病害，分布广，发病快，发病率高，易造成严重的经济损失，且有逐年加重的趋势，对猕猴桃产业发展产生了严重威胁。目前报道的猕猴桃软腐病病原菌有葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、拟茎点霉菌Phomopsis spp.(有性态Diaporthe spp.)、灰霉菌Botrytis cinerea、链格孢菌Alternaria spp.、青霉菌Penicillium spp.等，其中葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和拟茎点霉菌Phomopsis spp.(有性态Diaporthespp.)为主要致病菌。
[0003]目前，猕猴桃软腐病病原菌的检测鉴定主要依赖于传统的病原菌分离鉴定，主要包括症状观察、病原菌分离、显微形态观察及分子鉴定等，耗时较长，极不利于猕猴桃软腐病的早期检测及预防。PCR检测是最常用的一种分子生物学检测方法，可通过快速扩增病原微生物的特异性核酸序列，实现病原菌的快速检测，近年来已在传染病、食源性致病菌污染、环境污染、肿瘤遗传标记等领域广泛应用，是比较成熟且应用范围最广的检测技术。因此，研究开发适于猕猴桃软腐病病原菌的快速检测特异性引物及方法，对于猕猴桃软腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和经济意义。

技术实现思路

[0004]基于以上问题，本专利技术提供用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用，本专利技术可快速检测猕猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，检测准确度高，特异性高。
[0005]为解决以上技术问题，本专利技术提供了用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，所述引物组一包括正向引物B.d
‑
17和反向引物B.d
‑
393，所述B.d
‑
17和B.d
‑
393的核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述引物组二包括正向引物B.d
‑
84和反向引物B.d
‑
472，所述B.d
‑
84和B.d
‑
472的核苷酸序列分别见SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
[0006]进一步的，所述引物组用于PCR扩增时的扩增反应体系如下：采用25μLPCR反应体系，具体如下：10
×
Taq PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌ddH2O 18μL；
[0007]所述引物组用于PCR扩增时的扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，61℃
退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸5min。
[0008]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了引物组在制备用于检测猕猴桃软腐病病原菌Botryosphaeria dothidea的试剂盒中的应用。
[0009]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术可快速检测猕猴桃中的葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，检测准确度高，特异性高。
附图说明
[0010]图1为本专利技术的实施例的引物组特异性的PCR检测结果图；
[0011]图2为本专利技术的实施例的引物组准确性的PCR检测结果图。
具体实施方式
[0012]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。
[0013]实施例：
[0014]本实施例用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，引物组一包括正向引物B.d
‑
17和反向引物B.d
‑
393，引物组一可针对葡萄座腔菌特异性扩增出376bp的产物，其序列分别为：
[0015]B.d
‑
17：5
′‑
GCCCGATCCTCCCACCCTT
‑3′
；
[0016]B.d
‑
393：5
′‑
GAGGCGCGCCCGCAAAGGACGGT
‑3′
；
[0017]所述B.d
‑
17和B.d
‑
393的核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
[0018]引物组二包括正向引物B.d
‑
84和反向引物B.d
‑
472，引物组二可针对葡萄座腔菌特异性扩增出388bp的产物，其序列分别为：
[0019]B.d
‑
84：5
′‑
GGCCGCCCCCCTCCCCGG
‑3′
，
[0020]B.d
‑
472：5
′‑
CTGCGCTCCTAAGCGAGATGTATG
‑3′
；
[0021]所述B.d
‑
84和B.d
‑
472的核苷酸序列分别见SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
[0022]上述引物组可应用于制备用于检测猕猴桃软腐病病原菌Botryosphaeria dothidea的试剂盒中。
[0023]本实施例还提供了用于快速检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的方法，包括以下步骤：
[0024](1)待检测样品DNA提取
[0025]采用改良CTAB法进行提取，具体步骤如下：
[0026]a.称取待检测样品1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至2ml离心管中，加入600μl预热至65℃的2
×
CTAB(含2％巯基乙醇和2％PVPP)，颠倒混匀，65℃水浴45min
‑
1h；
[0027]b.取出离心管冷却至室温，加入600μl氯仿：异戊醇溶液(24：1)，振荡混匀，10000rpm离心10min；取上清液至另一1.5ml离心管中，再加入等体积氯仿：异戊醇溶液(24:1)，10000rpm离心10min；
[0028本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组，其特征在于，包括引物组一和引物组二中的任意一组或两组，所述引物组一包括正向引物B.d
‑
17和反向引物B.d
‑
393，所述B.d
‑
17和B.d
‑
393的核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述引物组二包括正向引物B.d
‑
84和反向引物B.d
‑
472，所述B.d
‑
84和B.d
‑
472的核苷酸序列分别见SEQ ID No.3和SEQ ID No.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗敏，李欢欢，刘永胜，刘奎，刘洪林，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：