用于辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明专利技术的分子标记在菊花任意发育时期均可用于辨别菊花白色锈病抗性，在菊花白色锈病抗性鉴定与抗病品种选育方面具有重要的科学指导意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
用于辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于植物分子领域，具体涉及一种辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用，可用于菊花白色锈病抗性鉴定及分子标记辅助选择育种。

技术介绍

[0002]菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花之一。菊花种类繁多、花型多变、色彩丰富，具有极高的观赏与经济价值，在园林绿化中广泛应用。菊花白色锈病是由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花专性寄生病害，发病时危害菊花叶片、幼茎、花部，乃至整个植株枯萎死亡，极大的降低了菊花观赏性。菊花白色锈病是世界性检疫病害，传染范围广泛，是菊花生产过程中最重要的破坏性病害之一，大面积发病将造成菊花产业的巨大损失，严重制约了菊花产业的发展。
[0003]分子标记辅助育种具有快速鉴定目标性状，方法简便、价格低廉，主要应用在植物基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴定等方面。目前尚无通过分子标记鉴定菊花白色锈病性状的方法。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记及其应用，能够在菊花任意发育阶段辨别菊花材料对菊花白色锈病的抗性，加快菊花育种进程。本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0005]一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
[0006]另一方面，本申请还保护一种根据上述的分子标记辨别菊花白色锈病抗性的方法，包括如下步骤：
[0007](1)菊花基因组DNA提取：
[0008]采用CTAB法，提取待测菊花基因组DNA；
[0009](2)PCR扩增全长序列：
[0010]PCR反应体系：包括2
×
高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
[0011]PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
[0012](4)全长序列纯化与克隆载体连接
[0013]①
全长序列纯化：利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂对目的片段进行纯化；
[0014]②
目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态；
[0015](4)阳性质粒鉴定与测序：
[0016]选取单菌落至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm条件下在37℃孵
育12小时，菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
[0017]利用质粒快速提取试剂盒提取质粒；
[0018](5)用质粒为模板，PCR扩增所述分子标记原始序列
[0019]PCR反应体系：包括2
×
Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
[0020]PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
[0021](6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR的产物：
[0022]限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；
[0023]酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10
×
酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；
[0024]酶切反应条件：37℃酶切60分钟；
[0025](7)酶切上述PCR产物后，进行琼脂糖凝胶电泳检测：
[0026]经凝胶成像仪成像后，当显示出523bp和99bp两条特异性条带时，为抗白色锈病的菊花；当显示出643bp特异性条带时，为感白色锈病的菊花。
[0027]进一步地，所述步骤(3)中
②
的具体步骤如下：
[0028]取
①
中获得的PCR纯化产物4μL，克隆载体溶液1μL，轻轻混合后25℃连接25分钟；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟；加入LB液体培养基600μL，200rpm条件下在37℃孵育1小时；取浑浊菌液200μL均匀涂布于加入50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基上，37℃条件下倒置培养过夜。
[0029]进一步地，所述Taq酶缓冲液含Taq酶0.2U、dNTPs 1μM及镁离子。
[0030]进一步地，所述方法在菊花发育任意时期均可鉴定菊花是否抗菊花白色锈病。
[0031]另一方面，本申请还保护一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记的获取方法，包括以下步骤：
[0032](1)菊花的培育：分别培育抗菊花白色锈病和感菊花白色锈病的菊花材料；
[0033](2)菊花基因组DNA提取：
[0034]采用CTAB法，分别提取抗菊花白色锈病和感菊花白色锈病的菊花基因组DNA；
[0035](3)菊花白色锈病基因全长克隆引物设计：
[0036]全长克隆引物包括上游全长克隆引物和下游全长克隆引物，相应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
[0037](4)PCR扩增：
[0038]PCR反应体系：包括2
×
高保真Taq酶缓冲液5μL，上游全长克隆引物1μL，下游全长克隆引物1μL，DNA模板1μL，去离子水2μL，总计10μL；
[0039]PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火50秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
[0040](5)琼脂糖凝胶电泳：
[0041]将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察条带位置；
[0042](6)扩增产物回收；
[0043](7)回收产物连接克隆载体，转化大肠杆菌；
[0044](8)测序：
[0045]测得抗菊花白色锈病的菊花核苷酸序列为SEQ ID NO：5，感菊花白色锈病的菊花核苷酸序列为SEQ ID NO：6；
[0046](9)合成用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记
[0047]根据步骤(8)中所得的核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，确定酶切位点为CATG^；设计合成所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和下游引物核苷酸序列SEQ ID NO：2。
[0048]进一步地，所述高保真Taq酶缓冲液含高保真Taq酶0.2U、dNTPs 1μM及镁离子。
[0049]与现有技术相比，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，其特征在于，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。2.一种根据权利要求1所述的分子标记辨别菊花白色锈病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菊花基因组DNA提取：采用CTAB法，提取待测菊花基因组DNA；(2)PCR扩增全长序列：PCR反应体系：包括2
×
高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；(3)全长序列纯化与克隆载体连接
①
全长序列纯化：利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂对目的片段进行纯化；
②
目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态；(4)阳性质粒鉴定与测序：选取单菌落至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm条件下在37℃孵育12小时，菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；利用质粒快速提取试剂盒提取质粒；(5)用质粒为模板，PCR扩增所述分子标记原始序列PCR反应体系：包括2
×
Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR的产物：限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10
×
酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；酶切反应条件：37℃酶切60分钟；(7)酶切上述PCR产物后，进行琼脂糖凝胶电泳检测：经凝胶成像仪成像后，当显示出523bp和99bp两条特异性条带时，为抗白色锈病的菊花；当显示出643bp特异性条带时，为感白色锈病的菊花。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中
②
的具体步骤如下：取
①
中获得的PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝朋芳，冯馨，于雨萌，毛洪玉，陈歆悦，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：